Physiological role of regulation involving Crh in Geobacillus kaustophilus

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02128
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 吉田 健一 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20230732)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 周 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 准教授 (30359872)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Geobacillus kaustophilus / Crh / イノシトール

Outline of Annual Research Achievements

GK親株にhprK G268R変異のみを導入しiol遺伝子群が発現しなくなる原因がこの変異に他ならないことを確証するために、まず元来存在するhpr K遺伝子を削除する必要がある。昨年度はこの遺伝子削除を進めたが、hprKの欠失により生育が低下するために、この変異株の作成に予定を上 回る時間と労力を要した。また、hprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現してい ることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhprK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためか これを確認することはできなかった。そこで、来年度はまずこの相補実験の完成を第1目標とし、この達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。 一方、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されるはずである。細胞内のCrh-Hisを精製して、リン酸化されP-Ser-Crh-Hisとなっていることを確認するとともに、細胞内クロスリンクによりP-Ser-Crh-Hisと相互作用する他のタンパク質因子を質量分析計によって同定して、Crhの第3制御機能に関わる「未知のパートナー」の特定に着手する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

GKにおいてはhprKの欠失により生育が低下するために、この変異株の作成に予定を上回る時間と労力を要した。しかし、結果的に得られたhprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現していることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhprK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためか これを確認することはできなかった。そこで、来年度はまずこの相補実験の完成を第1目標とし、この達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。

Strategy for Future Research Activity

hprK削除株においては、驚いたことに誘導物質の有無にかかわらずiol遺伝子群が完全に構成的に発現していることが判明した。この結果は、Crhのリン酸化がiol遺伝子群の抑制において必須であることを示唆する新たな発見でもある。さらに、このhp rK削除株に野生型のhprKあるいはhprK G268R変異を導入し、機能の相補を観察しようと試みたが、プロモーターの選定が不適切であったためか これを確認することはできなかった。そこで、まずこの相補実験の完成を第1目標とする。 次いで、この第1目標の達成によってもたらされる人工的なHPrK G268R変異株においてはiol遺伝子群が発現しなくなると予想されるので、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。加えて、HPr、CcpAならびにMgsAについても同様に破壊し、影響を検討する。 これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。 一方、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されるはずである。細胞内のCrh-Hisを精製して、リン酸化されP-Ser-Crh-Hisとなっていることを確認するとともに、細胞内クロスリンクによりP-Ser-Crh-Hisと相互作用する他のタンパ ク質因子を質量分析計によって同定する。これによって、Crhの第3制御機能に関わる「未知のパートナー」の特定に着手する。 別の研究テー マの進展により、IolQと名付けた制御因子がパートナー候補として浮上しているので、これを仮想パートナーと見なした実験も並行して進める。