2020 Fiscal Year Annual Research Report
Physiological role of regulation involving Crh in Geobacillus kaustophilus
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18H02128
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
吉田 健一 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20230732)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石川 周 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 准教授 (30359872)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Geobacillus kaustophilus / カタボライト抑制 / イノシトール / 転写制御 / タンパク質相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グラム陽性菌に広く保存されるCrh (Carbon-flux regulating HPr) は、グルコースなど優先的に利用される炭素源が存在する場合、他の炭素源の代謝を抑制するカタボライト抑制に関わる制御因子である。しかし、この想定機能は主たるカタボライト抑制を担うHPrと重複しており、予てより疑問を感じていた。そして、好熱性バチルスGeobacillus kaustophilus (GK)のイノシトール代謝系iol遺伝子群が、全くカタボライト抑制を受けないにも拘わらず、リン酸化されたCrhによって強く抑制される現象を発見して疑問は確信となった。本研究は、CrhによるGK iol遺伝子群の発現抑制の詳細解析を皮切りに、Crhが担う未知なるゲノム機能調節機構の解明を目的とする。
GK親株の野生型HPrKを削除し、それに代えてHPrK G268R変異のみを発現させることができず、未だ目的の相補実験の完成にいたることができなかった。しかし、野生型HPrKを残したままHPrK G268R変異を強発現するとiol遺伝子の発現が抑制され、また逆にHPrK G268R変異株において野生型HPrKを強発現するとiol遺伝子の発現抑制が解除された。また、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されることも確認できている。すなわち、HPrK G268R変異によるCrhの過剰なリン酸化がiol遺伝子群の発現を抑制するものであること、また野生型HPrKの過剰発現でCrhの過剰なリン酸化が解除されるという推定を証明することができた。野生状態の細胞内のCrh-Hisを発現させて、それと複合体因子をクロスリンクさせてHis-tagによる精製するシステムを構築することもできたので、Crhの「未知のパートナー」の検討準備も調った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GK親株の野生型HPrKを削除し、それに代えてHPrK G268R変異のみを発現させることができず、未だ目的の相補実験の完成にいたることができなかった。しかし、野生型HPrKを残したままHPrK G268R変異を強発現するとiol遺伝子の発現が抑制され、また逆にHPrK G268R変異株において野生型HPrKを強発現するとiol遺伝子の発現抑制が解除された。また、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されることも確認できている。すなわち、HPrK G268R変異によるCrhの過剰なリン酸化がiol遺伝子群の発現を抑制するものであること、また野生型HPrKの過剰発現でCrhの過剰なリン酸化が解除されるという推定を証明することができた。野生状態の細胞内のCrh-Hisを発現させて、それと複合体因子をクロスリンクさせてHis-tagによる精製するシステムを構築することもできたので、Crhの「未知のパートナー」の検討準備も調った。
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| Strategy for Future Research Activity |
GK親株の野生型HPrKを削除し、それに代えてHPrK G268R変異のみを発現させることがどうしてもできず、未だ目的の相補実験の完成にいたることができなかった。しかし、野生型HPrKを残したままHPrK G268R変異を強発現するとiol遺伝子の発現が抑制され、また逆にHPrK G268R変異株において野生型HPrKを強発現するとiol遺伝子の発現抑制が解除された。この結果は、強発現したHPrK遺伝子の機能が表現型に反映されたことを示唆しており、今年度はこの結果の検証を第1目標とする。 次いで、HPrK G268R変異を強発現した株においてはiol遺伝子群が抑制されており、この株においてCrhを破壊してiol遺伝子群の発現の回復を確認する。加えて、HPr、CcpAならびにMgsAについても同様に破壊し、影響を検討する。 これによって、従来のカタボライト抑制ならびにCrhと相互作用する因子とCrhの第3機能との関連を理解できると予想している。 一方、上記HPrK G268R変異+Crh破壊株においてCrh-Hisを発現させると、再びiol遺伝子群が抑制されるはずである。上記の通り、未だHPrK G268R変異+Crh破壊株が完成できておらず、こちらも足踏みが続いているが、これに先駆けて野生状態の細胞内のCrh-Hisを発現させて、それと複合体因子をクロスリンクさせてHis-tagによる精製するシステムを構築することができた。今年度は上記の遺伝子破壊株の作成と並行して、リン酸化されP-Ser-Crh-Hisとなっていることを確認するとともに、細胞内クロスリンクによりP-Ser-Crh-Hisと相互作用する他のタンパ ク質因子を質量分析計によって同定し、Crhの第3制御機能に関わる「未知のパートナー」が存在するのか否かを検討し、もしそれが存在するのならその特定を目指す。
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