2019 Fiscal Year Annual Research Report
Nitrogen Signaling Factor (NSF)-mediated cell-to-cell communication in fission yeast
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18H02131
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
八代田 陽子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 副チームリーダー (60360658)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平井 剛 九州大学, 薬学研究院, 教授 (50359551)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞間コミュニケーション / 分裂酵母 / オキシリピン / 窒素代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、高濃度アンモニアおよび十分量のロイシンを含む液体培地において、窒素源シグナリング因子（NSF）を含む分裂酵母野生株の培養液上清を添加しても適応生育が見られない分裂酵母の遺伝子破壊株を取得してきたが、寒天培地を用いてNSFの有無での適応生育を確認したところ、液体培地での試験と一致しない結果が得られた。液体培地試験で候補から漏れたものでも寒天培地でNSFそのものをかけた時には「候補」となるなどの不一致が見られた。そこで実験行程の再検証をしたところ、遺伝子破壊株のバックグラウンドから不必要な栄養要求性を取り除いたほうがクリアな結果が得られることを見出した。よって、ロイシン要求性のみ有する株を掛け合わせによって作製し、新たなライブラリーを準備することにした。このライブラリーを用いて、複数の培地条件下で、受容機構、および産生機構について関与する因子のスクリーニングを実施中であり、細胞膜に局在するタンパク質が受容機構の候補因子として挙がっている。
NSFの結合因子の同定実験においては、脂肪鎖先端にアルキンを導入したプローブを利用して条件検討を行った。アジドビーズにアルキン化プローブをクリックケミストリー反応で固定化し、分裂酵母ライセートと混合して結合タンパク質の検出を試みた。リガンド固定化ビーズへの非特異的な結合タンパク質が多く検出されたが、陰性対照として、オレイン酸のアルキン体を使用することで、プローブ特異的に結合するタンパク質候補が見出されている。
NSFは、培養液上清の酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムで分画後、適応生育活性の最も強い画分（#3）から単離、精製した。そこで、次に活性の強い画分（#5、#6）について、逆相カラムを用いてさらなる分画を行ったが、どの画分にも活性が認められなかった。分離条件の再検討を予定しているが、活性因子が複数あり、分散した可能性もある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子破壊株ライブラリーセットの再構築など実験系の見直しもしているが、全体としては概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規に作製したロイシン要求性のみをバックグラウンドにもつ遺伝子破壊株ライブラリーのスクリーニングを完了させ、NSF受容および産生機構に関与する因子を同定し、検証する。物理的相互作用検出用プローブを検討、選抜し、分裂酵母ライセートからのNSF結合因子の探索および遺伝子破壊株スクリーニングからの候補因子の検証に用いる。適応生育の記憶維持機構解明においては、マイクロアレイ結果やスクリーニング結果を総合して追究する。新規の適応生育誘導因子同定については、別条件の検討、別分画を用いての探索や市販の脂肪酸ライブラリーからの候補・その類縁体の検証を実施する。
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