2019 Fiscal Year Annual Research Report
アスパラギン酸経路・鍵酵素の複合体形成機構および活性調節機構の構造学的解析
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18H02138
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
櫻庭 春彦 香川大学, 農学部, 教授 (90205823)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 超好熱菌 / アスパラギン酸キナーゼ / ホモセリン脱水素酵素 / アスパラギン酸経路 / Thermotoga maritima / アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
必須アミノ酸であるスレオニン・メチオニンはアスパラギン酸経路により合成される。植物では、本経路の活性調節によって上記アミノ酸含量が決まるため、酵素改変による作物の栄養価改善が期待される。しかし、この経路の第一段階のアスパラギン酸キナーゼ（AK）と第三段階のホモセリン脱水素酵素（HseDH）の活性調節機構は不明な点が多い。この二つの酵素は融合して二機能型酵素（AK-HseDH）として機能する例が多いが、なぜ第二段階の酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（AsaDH）が含まれないのか未だに謎となっている。また、AK-HseDHは不安定なため構造解析例が無い。本研究では、超好熱細菌Thermotoga maritimaに見出した安定性の高いこれら酵素の構造解析を通して、活性調節・複合体形成機構の解明を目指す。これにより、作物のアミノ酸栄養価を高める技術開発に繋がる研究基盤を構築する。
80℃付近の高温で生育する超好熱細菌T. maritimaに超好熱菌で初めて二機能型AK-HseDHを見出し、大腸菌における大量生産に成功している。また、このAK-HseDHがリジン非感受性であるがスレオニンにより阻害を受けることを明らかにした。一方、T. maritimaには単一機能型AKも存在し、スレオニン非感受性であるがリジンにより阻害を受けることが判明した。この点からAK-HseDHと単一機能型AKで役割分担がなされている可能性が示された。T. maritima 由来のAK-HseDH融合酵素および単一機能型AKの構造解析を行い、AK-HseDH のスレオニンによる阻害メカニズムを解明し、また単一機能型AKについてはリジンによる阻害メカニズムの解析を進め、活性調節機構を明らかにしていく必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌で生産させたT. maritima の二機能型AK-HseDHの良質な結晶は、まだ得られていないが、その酵素化学的性質を明らかにしている。一方、T. maritimaには単一機能型AKも存在することを見出し、大腸菌における遺伝子発現系を構築し、産物の精製法を確立した。また単一機能型AKは、スレオニン非感受性であるがリジンにより阻害を受けることが判明した。アスパラギン酸経路ではホモセリンから必須アミノ酸であるスレオニン、メチオニン、イソロイシンが生合成される。経路中のアスパラギン酸セミアルデヒドからはリジンが生合成される。これまでの研究において、T. maritima の二機能型AK-HseDHのAK活性はL-スレオニンにより強力に阻害を受けることが判明し、L-スレオニン生合成系に関与していると考えられる。一方、単一機能型AKはL-リジンに対する感受性が高いことから、L-リジン生合成系に関与している可能性が高い。このように、T. maritima 内のアミノ酸生合成経路において二機能型AK-HseDHと単一機能型AKが役割分担をしている点が示唆されたことは大きな成果といえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸菌で生産させたT. maritima の二機能型AK-HseDHの精製方法を確立している。酵素化学的性質を解析し、スレオニンにより強力に阻害を受けることを明らかにした。本酵素の良好な結晶は得られていないため、引き続き結晶化条件のスクリーニングを行う。また、アスパラギン酸経路の第二段階の酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（AsaDH）について精製方法を確立したので、結晶化条件のスクリーニングを行う。さらに精製したAK-HseDHとAsaDHを混合し、共結晶化を試みる。AK-HseDH、AsaDH単独、およびAK-HseDH/AsaDH複合体の結晶構造を解析する。これらの構造を比較することで複合体形成様式を明らかにする。
単一機能型AKのスレオニン、リジンに対する感受性を調べたところ、スレオニン非感受性であるがリジンにより阻害を受けることが判明した。この酵素の構造解析を行い、上記AK-HseDH（リジン非感受性であるがスレオニンにより阻害を受ける）の構造と比較することにより感受性・非感受性の違いを明らかにする。また単一機能型AKとリジンとの共結晶化を行い、これらが結合した構造を解析し、結合様式を明らかにする。
AK-HseDHまたはAK-HseDH/AsaDH複合体とスレオニンとの共結晶化を行い、これらが結合した構造を解析し、結合様式を明らかにする。すでに構造解析に成功しているP. horikoshii HseDHはスレオニン非感受性であるため、構造比較によりスレオニンによる阻害メカニズムを明らかにする。これに基づき、阻害を解除した変異体酵素の作成を試みる。また、単一機能型AKとリジンとの共結晶化を行い、これらが結合した構造を解析し、結合様式を明らかにする
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