2019 Fiscal Year Annual Research Report
ゴール形成昆虫による植物ホルモン生産能の進化的獲得機構の解明
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18H02141
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
鈴木 義人 茨城大学, 農学部, 教授 (90222067)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ゴール / 昆虫 / オーキシン / サイトカイニン / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，ゴール形成昆虫による植物ホルモン（オーキシンおよびサイトカイニン）の生合成能とゴール形成能との関係性を示すために，両ホルモンの生合成機構を明らかにしようとしている．オーキシン（indole-3-acetic acid, IAA）については，Trp→IAOx→IAAld→IAAあるいはTrp→IAAld→IAAの経路が機能していること，この中でTrp→IAOx，Trp→IAAldの変換が律速段階であり、それぞれを触媒するゴール形成昆虫ハバチの候補酵素として、PonFMO1およびPonAAS2を見出していた。今回、これらの酵素を大腸菌にて十分量発現させることに成功したが、その結果PonFMO1は極めて弱い活性しか示さないのに対して，PonAAS2は強い活性を有していた。抗PonAAS2抗体を調製し、本酵素がハバチ幼虫の体内に存在すること，また，IAA内生量とPonAAS2の遺伝子発現量に時期的相関性があることも分かり，ハバチではTrp→IAAld→IAAが主要なIAA生合成経路であることが判明した。サイトカイニンについては，その生合成の鍵酵素であるisopentenyl transferase（IPT）がハバチ上に1つしかないが，本酵素の大腸菌における発現により，tRNA上のアデニンを修飾するtRNA-IPTとしての活性しかないことが判明した。また，ハバチのtRNA上にはIP化されたアデニンしかなく，ハバチに大量に存在するtZやtZRの様な側鎖が水酸化されたアデニンはtRNA上では生成していないことが分かった。酵母発現系を利用して，水酸化酵素の候補として20種類程度のP450のスクリーニングを行ったが，いずれからも活性が見いだせなかった．一方，rRNA枯渇法によって調製したRNAを用いたRNA-seq解析の結果は，生合成への共生微生物の関与を支持しない結果となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度難航していた組換えPonAAS2の大量調製に成功し，強い変換活性が確認出来たこと，その変換ステップが律速段階であり，IAAの生合成の調節に関与していると考えられること，また，ハバチ体内に存在しており，IAA内生量と遺伝子発現量に相関性が認められたこと，これらの結果を総合的に考えると，ハバチがゴール形成能を進化的に獲得した際の重要な遺伝子であると考えられ，今後更にフォーカスを当てて研究すべき対象が明らかになったと言える。サイトカイニンについては，ポジティブな結果は得られていないものの，ただ１つ存在するIPTがtRNA-IPTであることが明らかとなり，しかもハバチのtRNA上では水酸化が起こっていないことが判明したことから，サイトカイニンの生合成経路として，tRNAを介して生成したイソペンテニルアデニンリボチド，あるいはイソペンテニルアデニンリボシドが水酸化を受ける経路を想定すべきであることが分かったことから，やはり今後の研究対象を絞り込んだと考えることができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
PonAAS2については，ハバチの抽出物から免疫沈降，あるいはアフィニティークロマトグラフィーによって当該酵素活性を除去した時の，酵素活性の低下率を測定し，本酵素のIAA生合成への寄与率を明らかにする。ハバチではIAAld→IAAの変換酵素としてPonAO1が想定されているが，大腸菌等の組換えタンパク質では弱い活性しか得られていない。一方，線虫や，これまでに調べた全ての昆虫がIAAld→IAAの変換活性を持つことから，この変換へのAO関与の普遍性を明らかにすると同時にPonAO1の活性を確認することを目的に，ゲノム編集によりC. elegansのAOを破壊すると共に，PonAO1を導入して活性試験を行う。また，PonAAS2を導入することにより，C.elegansにIAA生産能を付与する。この研究は，その先にアブラムシ等，ゴール形成昆虫における応用を見据えており，ゲノム編集により植物ホルモン生産能を与えることによって，疑似ゴール形成昆虫を作製することへとつなげる。サイトカイニンについては，tZ，tZR等の水酸化された側鎖を持つサイトカイニンを有する昆虫におけるtRNAの水酸化の状況をさらに確認する。また，共生微生物の存在が確認されているアブラムシ，ショウジョウバエ等から共生微生物を除いて，サイトカイニンの構成に変化が現れるかを解析する。これらを通して，共生微生物の関与の有無，tRNAを介したサイトカイニン生合成の可能性，また水酸化のタイミングなどに結論を出す。一方で，水酸化酵素の候補遺伝子としてP450以外にも枠を広げてスクリーニングを行う。
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