2020 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on color change of seed coat of edible beans during maturation
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18H02146
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
吉田 久美 名古屋大学, 情報学研究科, 教授 (90210690)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾山 公一 名古屋大学, 物質科学国際研究センター, 技師 (80402460)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Glycine max / cyanidin 3-glucoside / flav-2-en-3-ol 3-O-glc / anthocyanin biosynthesis / anthocyanidin synthase / Glycine soja |
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| Outline of Annual Research Achievements |
登熟した黒大豆種皮には、シアニジン3-グルコシドが多量に含まれる。さらに、未熟な緑色の黒大豆種皮には、その前駆体と推測される3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシド（2-フラベノール体）が含まれることを昨年度までに明らかにした。2-フラベノール体が本当にアントシアニン色素の前駆体であるならば、従来知られていない全く新しいアントシアニンの生合成経路の発見となる。この証拠を得るために、通常の莢中で2ヶ月程度かかる登熟に伴うこれら物質の変化、ならびに、未熟な時に莢から出して明所、空気中に暴露した際の24時間以内におきる急速な種皮の黒化現象の際の両化合物の変化を定量分析した。それぞれの化合物について、定量NMR法による絶対純度の決定後にこの試料を用いてHPLCによる検量線を作成した。
いずれの場合も、2-フラベノール体の減少に伴ってシアニジン3-グルコシドが増加した。莢から出して急速に黒化した際には、前駆体に減少量に応じた量のアントシアニンが生成することが明らかになった。さらに、未熟種皮から抽出した粗タンパク質混合物を用いて、この反応が加速されるかどうか調べたところ、この反応には酵素は関わっていない可能性が強く示唆された。
これにより、高等植物において最も普遍的に分布し、かつ最も単純な構造のアントシアニンであるシアニジン3-グルコシドの黒大豆種皮における生合成は、有色物質のシアニジンになってから配糖化されるのではなく、先に3位が配糖化された、極めて酸化されやすい前駆物質である3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシドが未熟な時から集積し、これが空気酸化されることによってシアニジン3-グルコシドとなる新たな経路によることがわかった。
さらに、生合成に関わる遺伝子をクローニング済みである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
黒大豆種皮色素の生合成の研究に関しては、アントシアニン前駆体と推測される分子である、3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシドの合成法を確立して、種皮の含有量の定量分析を実施でき、新たな生合成経路の存在を実証したことは、本分野における大きな進展と考える。
また、すでに、黒大豆から、アントシアニン生合成において、最初の有色化合物ができる鍵酵素と考えられているANS遺伝子をクローニングし、酵素タンパク質も調製済みである。3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシドとの反応を試みることができる状況にある。
小豆種皮の紫色色素であるカテキノピラノシアニジン類の研究に関しては、すでに完全な構造決定をおこなっており、今後は、この色素の生合成経路の解明に向けて、未熟小豆からの前駆体の探索を実施している。また、２種類の色素を単離済みであるが、さらに同様の紫色を発色する色素の単離を進めており、類縁体の構造決定ができる状況に進みつつある。
今後、黒大豆の原種であるツルマメの分析を進め、同様の前駆体が存在するかどうか、同じ経路でシアニジン3-グルコシドが生合成されるかどうかについても調べる準備が整っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
黒大豆種皮におけるシアニジン3-グルコシドの生合成経路の研究に関しては、従来考えられてきた生合成経路で関与するとされている酵素タンパク質の、アントシアニジン合成酵素（ANS）およびその周辺のジヒドロフラボノール還元酵素（DFR）、アントシアニジン3位グルコース転移酵素（3GT）、さらにはアントシアニジン還元酵素（ANR）をクローニングして、登熟にともなう遺伝子の発現解析、ならびに、酵素タンパク質の調製、基質候補化合物の合成、およびそれを用いた酵素化学反応を進め、特に、3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシドがなにから生合成されるのか、さらに、3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラブ-2-エン-3-オール 3-O-グルコシドがANSによってシアニジン3-グルコシドへ変換されるかどうかを調べる。
また、黒大豆の原種であるツルマメについても、同様の前駆体が存在するかどうか、明所での空気暴露によりシアニジン3-グルコシドへ変換されるかどうかを調べると同時に、遺伝子の探索、発現解析を実行する。これらにより、黒大豆におけるシアニジン3-グルコシド生合成の全貌を解明する。
赤小豆種皮色素の研究に関しては、色素の還元体の候補としてカテキノピラノシアニジン類のシアニジン部分が還元された形のカテキン二量体を各種分子設計し、これらの化学合成を試みる。さらに、未熟種皮抽出物をLC/MSにより分析して、候補の分子量を示すピークの探索を行い、色素生合成の機構の解明をはかる。同時に、未熟種皮の段階で検出されるアントシアニン類の単離と構造解明、ならびに、これらが登熟すると減少する仕組みの解明を試みる。
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[Journal Article] The peculiarity of Malvidin 3-O-(6-O-p-coumaroyl)glucoside aggregation. Intra and intermolecular interactions.2020
Author(s)
Mendoza, J., Oliveira, J., Arajo, P., Baslio, N., Teixeira, N., Bras, N. F., Pina, F., Yoshida, K., de Freitas, V.
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Journal Title
Dyes Pigments
Volume: 180
Pages: 08382
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Determination of anthocyanins and antioxidants in ‘Titanbiscus’ edible flosers in vitro and in vivo.2020
Author(s)
Chensom, S., Shimada, Y., Nakayama, H., Yoshida, K., Kondo, T., Kasuzaki, H., Hasegawa, S., Mishima,T.
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Journal Title
Plant Food Human Nutr.
Volume: 75
Pages: 265-271
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] 5,7,3',4-Tetrahydroxyflav-2-en-3-ol 3-O-glucoside, a new biosynthetic precursor of cyanidin 3-O-glucoside in the seed coat of black soybean, Glycine max.2020
Author(s)
Yoshida, K., Teppabut, Y., sawaguchi, R., Nakane, Y., Hayashi, E., Oyama, K-i., Nishizaki, Y., Goda, Y., Kondo, T.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 17184
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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