2020 Fiscal Year Annual Research Report
コレラ菌NADH-ユビキノン酸化還元酵素の阻害剤抵抗性メカニズムの解明
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18H02147
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三芳 秀人 京都大学, 農学研究科, 教授 (20190829)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | コレラ菌 / NADH脱水素酵素 / ユビキノン / コロルミシン / 生体エネルギー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「コレラ菌Na+-NQRの動きと抵抗性」の関係を精査することによって、本酵素特有の抵抗性獲得メカニズムの解明することである。そのために、Na+-NQR を機能性分子で化学修飾するという有機化学的手法を基盤にして、酵素のコンフォメーション変化を直接的に観察する２つの実験系を確立することを試みて来た、本年度は、強力な阻害剤であるコロルミシンを鋳型として、ligand directed N-acyl-N-alkyl sulfonamide chemistry法（LDNASA化学法）に供することができるプローブ分子を合成した。このプローブ分子を用いて野生型酵素のNqrBサブユニットの求核性リシン残基に対してアジド基を導入することを実施した。導入したアジド基は、続く二次タグを導入するための化学修飾の足場として利用する。
具体的には、コロルミシンの側鎖部分にアジド基を有するN-acyl-N-alkyl sulfonamide基を導入する分子プローブを合成した。本プローブはコレラ菌Na+-NQRに対して高い結合親和性（強い阻害活性）を維持していることを確認した。合成した分子プローブを単離Na+-NQRに作用させてLDNASA化学法を実施した。その結果、本法では約10分以内で標識が完了することがわかった。これまでのトシル化学法に比べて大幅な時間短縮が可能となり、単離酵素が凝集してしまうという問題点を解決できた。
標識したNa+-NQRに蛍光プローブTAMRAを検出タグとして結合させ、限定酵素消化とLC-MS/MSでペプチドマッピングしたところ、NqrBサブユニットのN末端部分のLys22に特異的にアジド基が導入されていることがわかった。NqrB-Lys22は結晶構造では解かれていないため、今後、この残基の空間的な位置を予測することが期待できる。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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