2018 Fiscal Year Annual Research Report
食品中機能性成分における抱合・脱抱合過程を介した機能発現機構の解明
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18H02159
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| Research Institution | Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
生城 真一 富山県立大学, 工学部, 教授 (50244679)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
戸田 弘 富山県立大学, 工学部, 講師 (60608321)
伊藤 伸哉 富山県立大学, 工学部, 教授 (90213066)
西川 美宇 富山県立大学, 工学部, 研究員 (90749805)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | フラボノイド / 酵母 / UDP-グルクロン酸転移酵素 / 硫酸転移酵素 / 酵母 / 腸内細菌 / 脱抱合 / 加水分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題１：腸内細菌による抱合体脱抱合能を検証するために、栗原ら（石川県立大学）の開発したヒト由来常在腸内細菌培養系を用いた腸内細菌ライブラリーにおけるケルセチン抱合体の加水分解反応の解析を行った。ケルセチン抱合体はUDP-グルクロン酸転移酵素発現酵母を用いて部位特異的な抱合化をうけた４種のケルセチン抱合体を用いた。
63種の腸内細菌を用いてケルセチン加水分解反応を行ったところ、腸内細菌叢の違いによって加水分解能は異なることが明らかとなった。また、ケルセチングルクロン酸抱合体のグルクロン酸抱合を受けている部位によっても加水分解能が異なり、ケルセチン硫酸抱合体においては、酪酸生産菌及びビフィズス菌において高い加水分解能を示した。
課題２：代表的な腸内細菌の培養菌体を用いてケルセチン-グルクロン酸抱合体に対する加水分解活性を測定し、複数の菌株において有意にグルクロニダーゼ活性を示すことが明らかにされた。これらの菌株のうち、その全ゲノム情報がデータベースに公開されているLactobacillus brevis RO1, Lactobacillus gasseri, Ruminococcus gravus よりグルクロニダーゼ遺伝子配列を取得した。これらの配列を用いてアライメントを作成し、保存性の高い領域を特定した。これらの保存領域のアミノ酸配列から縮重プライマーを作成し、ヒト糞便サンプルより抽出したメタゲノムDNAサンプルに対してPCRを行った結果、いくつかの糞便サンプルにおいてグルクロニダーゼと思われる増幅断片が得られた。これらの増幅断片をクローニングし、その塩基配列を決定した結果、Faecalibacterium prausnitzii 由来グルクロニダーゼ遺伝子と高い相同性を示すことが明らかとなった。現在これらの遺伝子の発現および機能解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題１：腸内細菌叢におけるケルセチン抱合体脱抱合能の解析：好気条件下での培養が困難である腸内細菌を栗原らが確立した培養系を用いて培養しヒト由来常在腸内細菌におけるケルセチン脱抱合能を解析することに成功した。
課題２：腸内細菌由来加水分解酵素の網羅的探索と機能解析によるフラボノイド抱合代謝への関与：前述の腸内細菌におけるケルセチン脱抱合能解析の情報をもとに加水分解酵素遺伝子の探索が可能となり、遺伝子クローニング及び大腸菌発現系による機能解析をおこなうことに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題１：生体内においてポリフェノールは単一の修飾基のみならず複数の水酸基が異なる修飾（グルクロン酸/硫酸基、グルクロン酸/メチル基、硫酸基/メチル基）を受けることがあり、血中での抱合代謝物の同定においてはしばしば混乱を生じる単一修飾による抱合体と同様に、ヘテロ修飾による抱合体の化学合成は困難である場合が多く、異物抱合酵素発現酵母を用いた本製造方法は極めて有利である。これら酵母菌株な組み合わせによる逐次的な変換により、グルクロン酸/硫酸基/メチル基のヘテロな修飾基を有する抱合代謝物の製造を目指す。さらに、前年度で検証した腸内細菌による脱抱合の基質として認識されるか否かについても検討していく予定である。
課題２：腸内細菌由来加水分解酵素によるフラボノイド脱抱合能を分子レベルで解析するために、ヒト腸内細菌由来メタゲノムからのサルファターゼ遺伝子取得を伊藤らが開発したS-GAM法により行う。ヒト腸内細菌叢よりメタゲノムDNAを抽出し、サルファターゼ遺伝子源とする。遺伝子配列データベースより各種微生物由来サルファターゼ遺伝子の配列を取得し、系統樹による分類および保存領域の選定を行う。各サルファターゼファミリーの保存領域に特異的な縮重プライマーを設計し、調製した腸内細菌メタゲノムDNAを鋳型としてPCRを行う。この発現プラスミドを鋳型として、Inverse PCRによりドナーベクターの調製を行う。調製したドナーベクターおよびメタゲノムよりPCR増幅したサルファターゼ遺伝子断片を、インフュージョン法によりシームレスに連結し大腸菌へクローニングする。得られた形質転換体をライブラリーとし、サルファターゼ活性を指標とする
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