2019 Fiscal Year Annual Research Report
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18H02194
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
樋口 洋平 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 講師 (00746844)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久松 完 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 野菜花き研究部門, ユニット長 (00355710)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | キク / 光周性花成 / 絶対的短日植物 / 活性型フィトクロム / 概日時計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、キクの光周性花成反応における暗期長認識機構について、申請者らが整備した高精度なゲノム・遺伝子解析ツールを駆使して明らかにする。「電照菊」で知られるキクの花芽分化は、光周期の変化に鋭敏に応答して発現する「アンチフロリゲン（AFT）」が重要な役割を果たす。AFTの発現誘導には日没を起点とした概日リズムが作り出す光誘導相とフィトクロム (PHYB)シグナルの相互作用が必須であるが、AFTの転写制御を担う因子は明らかとなっていない。本研究では、PHYBの下流でAFTの発現制御に関わる概日時計因子を明らかにすることにより、キクの暗期長認識機構について明らかにすることを目的としている。
予備的なスクリーニングで得られている恒常的活性型PHYB (BYH)のターゲット候補遺伝子について、引き続きGI (CsGI, CsGI2), PRR7 (CsPRR7, CsPRR37) , CO-like (CsCOL1)相同遺伝子を標的としてCRISPR/Cas9による遺伝子破壊株の作出に取り組んだ。前年度までの極めて低い遺伝子破壊効率を改善するため、pDeCas9-KanベクターのCas9発現カセットについて翻訳エンハンサー (AtADH 5’UTR)の挿入とHSP terminatorへの改変を行った (pDeCas9-mod)。加えて、guide RNAの発現量を改善するため、キクタニギク内在性のU6 promoterを4種類単離し、gRNA転写カセットに組み込んだ。また、キクタニギク概日時計の明暗周期による同調メカニズムを明らかにするため様々な光周期条件下での概日時計関連遺伝子の発現解析を行った結果、キクタニギクでは明期における概日リズムの自由継続性が弱く、暗期開始時に同調を受けやすいことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
活性型PHYBのターゲット遺候補遺伝子として注目したGI, PRR7, COLについて、双子葉植物用のpDeCas9_Kanを用いて2もしくは4箇所の標的配列に対してゲノム編集を試みたが、変異の導入は確認されなかった。キクタニギクにおける極めて低い変異導入効率を改善するため、Cas9の転写・翻訳量を上昇させる目的として翻訳エンハンサーとHSP terをベクターに導入し、さらにgRNAの転写量を上昇させるためキクタニギク内在性のU6 (CsU6)プロモーターを全ゲノム配列上で探索した。AtU6 pro配列を基にblast検索により探索した結果、キクタニギクのゲノム配列上から4種類のCsU6 (CsU6-1, 2, 3, 4) proを単離し、gRNA発現ベクター上のAtU6 proと置換した。CsU6 proの有効性を評価するため、既に切断実績が確認されているgRNA配列 (CsCYC2c, e)の上流に組み込み、従来のAtU6 proとの切断効率を比較検討している。また、切断効率をより迅速に評価するため、プロトプラストにCRISPR/Cas9 vecを一過的に導入し、変異箇所の検出を試みた。また、PRR7のHAタグ付き過剰発現（PRR7-HA）およびPRR7-SRDX形質転換体を得て、開花反応を調査した結果、それぞれ野生型と比較して開花抑制、開花促進の表現型を示し、PRR7が開花抑制に作用することを確認した。また、キクタニギク概日時計の明暗周期による同調メカニズムを明らかにするため様々な光周期条件下での概日時計関連遺伝子CsLHYの発現解析を行った結果、キクタニギクでは明期における概日リズムの自由継続性が弱く、暗期開始時に同調を受けやすいことが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに取り組んだCRISPR/Cas9による複数遺伝子のゲノム編集実験の結果から、キクタニギクにおけるターゲット遺伝子の切断効率が極めて低いことが明らかとなった。この問題を解決するため、CRISPR/Cas9ベクターの改変および組織培養条件の改良を進行中であり、引き続き前年度までに施したベクター改変の効果を安定形質転換体とトランジェントの系で検証していく。具体的には、前年度に単離した4種類のCsU6 promoterに改変したベクターを用い、既に切断実績のあるターゲット配列 (CsCYC2c, e)に連結してプロモーターの影響を検証すると同時に、CsGI/GI2, CsPRR7/PRR37, CsCOL1/2/3等の遺伝子破壊に並行して取り組み、これら遺伝子の破壊株が作製でき次第、人工気象器を用いて花成反応の評価に取り組む。また、前年度に作製し、開花抑制がみられたPRR7-HA形質転換体において、8hあるいは12h日長条件で野生型と比較してAFTの発現上昇（FTL3の発現抑制）が確認されたことを受け、今年度の新たな試みとして、これまでに得られているPHYB, GI, PRR7のHAタグ付き過剰発現体を活用し、ChIP-seqによる直接ターゲット遺伝子の同定を試みる。加えて、前年度から引き続き、概日時計の同調に関与することが知られているELF3, ELF4, LUX等の機能解析について、CRISPR/Cas9 vectorの改変と並行して取り組む。また、キクにおける概日リズムの同調機構を推定するため、前年度に実施したCsLHYの発現解析に加え、異なる長さの明期とその後の連続暗期を組み合わせた光周期条件においてGI, TOC1, LUX等の概日時計関連遺伝子の詳細な発現解析に取り組む。
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Research Products
(1 results)
