2020 Fiscal Year Annual Research Report

Analysis of ethylene biosynthesis regulated by ACC synthase phosphorylation

Research Project

Project/Area Number	18H02196
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	森仁志名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20220014)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	エチレン生合成 / ACC合成酵素 / タンパク質リン酸化 / タンパク質脱リン酸化
Outline of Annual Research Achievements	ACC合成酵素を脱リン酸するprotein phosphatase PP2Aを同定する予定だった。特にその中で脱リン酸する基質を決めるBサブユニットを同定する必要がある。シロイヌナズナ野生型と突然変異体のPP2Aサブユニットの違いをiTRAQラベル法により質量分析計を用いて解析した。その結果、16種類あるBサブユニットの中でも、B''サブユニットグループが候補となった。ここで本来の目的であるトマトのPP2Aに材料を変えた。B''サブユニットグループ内に5つのサブユニットがあり、どのサブユニットが結合するか明らかにする必要があった。そこで各B''サブユニットタンパク質とACC合成酵素のタンパク質間相互作用を明らかにするために、AlphaScreen法で解析した。ACC合成酵素のC末端にはFlagアミノ酸配列を付加し、B''サブユニットタンパク質のN末端にmycアミノ酸配列を付加した。両タンパク質ともに小麦胚芽無細胞タンパク質合成系で合成し相互作用を解析したが、AlphaScreen法でタンパク質間相互作用を明らかにすることができなかった。基本的にAlphaScreen法でタンパク質間相互作用を明らかにするために必要なタンパク質量が少ないのか、条件が適正でないのか依然として課題は残る。もう一つの課題である「ACC合成酵素をリン酸化状態でBサブユニットと反応させる」点も解決できていない。元々PP2Aはリン酸化タンパク質を相手にするので、ACC合成酵素をリン酸化酵素CDPKでリン酸化する、あるいはACC合成酵素のリン酸化されるセリン残基をアスパラギン酸残基に変換して擬リン酸化状態にして、タンパク質間相互作用を解析するという戦略を取ったが、まだ成果が出ていない。候補として想定したBサブユニットが適切でない可能性も残る。これらの点に関して今後の解析が期待される。
Research Progress Status	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。