タバコモザイクウイルスＲＮＡ複製複合体前駆複合体形成機構の解析

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02210
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 石川 雅之 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, ユニット長 (70192482)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ウイルス / 複製 / RNA

Outline of Annual Research Achievements

タバコモザイクウイルス (TMV) RNAにコードされる130Kタンパク質とそのリードスルー産物である180Kタンパク質は、RNA複製に関与する。膜を除去したタバコ脱液胞化プロトプラスト抽出液 (mdBYL) でTMV RNAを翻訳すると、両タンパク質とTMV RNAを含む複製複合体前駆複合体PMTCが、翻訳と共役して形成される。130Kタンパク質のみをコードするTMV-130 RNA（180Kタンパク質リードスルー部分を欠失；以降の実験は近縁のトマトモザイクウイルスの配列を用いて行った）をmdBYLで翻訳すると、翻訳と共役してPMTC様の複合体が形成され、その複合体（「core PMTC」と呼ぶ）を180Kタンパク質およびBYL由来の生体膜と混合するとTMV-130 RNAの複製が起きる。180Kタンパク質はcore PMTCに組み込まれ、複製複合体形成に向かうと考えられる。本年度は、180Kタンパク質のcore PMTCへの組み込み機構の解析を行い、100,000 x g 遠心上清画分（TMV RNAは含まれない）の180Kタンパク質が130Kタンパク質と結合しうることを見いだした。PMTC形成は、蔗糖密度勾配遠心法を用いて解析したが、この過程で、試験管内転写反応により人工合成したTMV RNAが、感染植物から精製したウイルス粒子から精製したRNAに比して低いPMTC形成効率を示すことを見いだした。
TMV 130K複製タンパク質からヘリカーゼドメインを欠失させたMetIR断片は、翻訳とは独立してTMV RNAの5'末端近傍領域（標的領域）に結合し複合体を形成する（形成された複合体を「MetIR PMTC」と呼ぶ）。MetIR PMTCの形成にはmdBYLの添加が必要である。本年度は、MetIR PMTC形成への分子シャペロンの関与を検討するために、HSP70, HSP90, cyclophilin あるいはFKBPの阻害剤を添加したが、複合体形成への影響はみられなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

試験管内転写反応で人工合成したTMV RNAが、感染植物から精製したウイルス粒子から精製したRNAに比して低いPMTC形成効率を示すことが判明し、予定していた実験の一部に着手できずにいる。

Strategy for Future Research Activity

先ず、本研究を進めるにあたって、試験管内転写反応で人工合成したTMV RNAのPMTC形成効率が低いことは大きな問題であるため、その効率を上げることに注力する。具体的には、転写開始点付近の配列の再検討、修飾塩基の導入等を試み、問題を解決した上でPMTCへの180Kタンパク質の組み込み機構の解明、MetIR PMTC形成補助因子の同定を試みる。