2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a molecular delivery system targeting to fish eggs: mass-production of the transporter by bio-reactor
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18H02272
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
平松 尚志 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (10443920)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東藤 孝 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (60303111)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオリアクター / 魚卵 / 物質輸送 / ビテロジェニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は卵や仔魚への様々な有効物質を輸送する分子輸送システムを開発することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。
１．前年度よりも輸送体発現量の更なる増大を期待し、トラウトビテロジェニンプロモーター（tVGP）をメダカの主要VtgサブタイプであるVtgAa1のプロモーター（mVGP）に変更し、その下流に同Vtgのシグナルペプチド（SP）、受容体結合領域の一部（SE）と蛍光蛋白質mCherry（mCh）を配置した組換えメダカ（mVGP/Aa1SP/SE/mCh）初世代（F0）を作出した。この組換え仔魚は肝臓においてエストロジェン応答性の蛍光発現を示し、組換え魚の作出と組換え蛍光輸送体の発現が確認できた。
２．上記組換え雌個体を成魚まで育成し、肝臓・卵巣での蛍光観察を行った結果、肝臓のみに蛍光性が観察された。肝臓・血液・卵巣抽出試料を用いてa-mCh抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、肝臓では免疫陽性反応を示すバンドが確認できたものの、血液や卵巣では確認できず、肝臓からの蛍光輸送体の分泌が無い、もしくは極めて少ない可能性が示唆された。
３．卵巣での蛍光性が確認できない主要因を肝臓からの蛍光輸送体の分泌不全によるものと考え、実施計画を少し変更し、mVGP下流に同VtgのSPとそれに直接続くSEを含む900-1500bpの受容体結合部位（SE900-1500）、mChまたは緑色蛍光タンパク質（GFP）を配置した新しい遺伝子導入ベクターコンストラクトを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R2年度研究実施計画に挙げた計画について、概ね順調に進展している。R2年度では、組換え魚での蛍光輸送体発現はプロモーターを変えても確実にできることが実証されたが、一方で肝臓からの分泌不全を確認した。このことを踏まえ、いち早くこれを解決する方策へ切り替えているため、R3年度中には、新たに作製中の組換え魚において、卵への蛍光輸送体の輸送ができると考え、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は以下の点において効率化・改善を求め研究を実施する。mVGP/Aa1SP/SE900-1500コンストラクトはメダカ生体内のVtgAa1遺伝子と同じ構成配列を持つことになり、分泌性が向上すると期待される。また、卵内でのmCh分解による蛍光性喪失の可能性を補完するため、GFPを追加した。更に、メダカVtgAa1遺伝子上へ直接蛍光タンパク質DNAを挿入することで、蛍光輸送体の確実な分泌を担保しようと考えた。
１．mVGP/Aa1SP/900-1500SE/mCh（あるいはGFP）組換えメダカを作出し、組換えAa1SP/900-1500SE/mCh（あるいはGFP）の発現と輸送性状を確認する。
２．上記１．のmChをmSAに変更したベクターコンストラクトを構築し、そのメダカゲノムDNAへの導入を試みる。
３．メダカゲノムDNA上のVtg遺伝子内へ直接mChまたはGFPを挿入するためのベクター構築を行う。
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