2020 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanisms underlying production of oocyte maturation inducing hormone in teleost
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18H02275
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90425421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究院, 特任教授 (40231930)
柴田 安司 帝京科学大学, 生命環境学部, 准教授 (80446260)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 20β-HSD / Hsd17β12L / ウナギ / チョウザメ / ティラピア / メダカ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）アムールチョウザメ、コチョザメのHsd17β12L：それぞれ複数のmRNAバリアントが存在するが、17α-ヒドロキシプロゲステロン（17OHP）を17α,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン（DHP）に転換する強い20β-HSD活性を持つHsd17β12Lをそれぞれ同定した。両種とも17β-HSD活性は持たないことも明らかになった。
２）アムールチョウザメ卵濾胞培養においてもLH存在下で17OHPから産生される主要ステロイドはDHPであることがわかり、本種の卵成熟誘起ステロイドホルモン（MIS）はDHPであることが濃厚になった。
３）アムールチョウザメにおいて、排卵誘導時に卵濾胞におけるHsd17β12L発現は高まり、培養卵濾胞においても、LHによってDHP産生とHsd17β12L発現が誘導されることがわかった。つまり、排卵誘導時に産生されるDHPはHsd17β12Lによって産生されることが強く示唆された。
４）アムールチョウザメにおいて新たに複数のCyp17a1パラログを同定したが、高い酵素活性を示すタイプは存在しなかった。チョウザメのCyp17a1はプロゲステロンをアンドロステンジオンに転換する強い活性は持たないのかもしれない。
５）LHサージによるHsd17β12Lの転写開始誘導機構：サクラマスの培養顆粒膜細胞においてフォルスコリン刺激でDHP産生能が高まる時に発現上昇する転写因子群を複数選抜した。これを基にメダカにおけるオーソログ遺伝子を同定した。
６）GFP強制発現バキュロウイルスによる魚類各種初代培養細胞への遺伝子導入を試行したが、それぞれの自家蛍光により解析が困難であった。解析を可能にするために、RFP強制発現バキュロウイルスを新たに開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）Hsd17β12L：これまでに、メダカ、ティラピア、アムールチョウザメ、コチョウザメのHsd17β12Lの解析を完了し、Hsd17β12L発現量が上昇することでDHPが産生され、卵成熟・排卵が誘起されるという機構が共通していた。しかし、ウナギではその発現上昇は緩やかであり、チョウザメ類でもサクラマス等で見られるような劇的な上昇ではないことから、この2種ではHsd17β12Lの発現上昇よりも17OHP産生制御によってMIS産生が調節されているのかもしれない。両種では卵成熟時の17OHP産生制御機構をさらに調べる必要がある。
２）チョウザメ類のMIS産生機構：アムールチョウザメ、コチョウザメともに強い20β-HSD活性を持つHsd17β12Lを同定し、排卵誘導時に発現が高まり、培養卵濾胞でもLHによって発現が誘導されることがわかった。チョウザメでもHsd17β12Lが卵成熟時にMISを産生する酵素であることが強く示唆されたことから、これまで調べた条鰭類全ての魚種において、CR/20β-HSDではなくHsd17β12LがMISを直接産生する20β-HSDをコードする遺伝子であることが確からしくなった。
３）Hsd17β12L遺伝子発現調節機構：LH刺激とHsd17β12L遺伝子発現の間には未知因子が介在していると予想されることから、未知因子の絞り込みをサクラマスで行い、メダカのオーソログ遺伝子も同定した。それら因子のHsd17β12L遺伝子発現への関与を今後調べる。
４）Cyp17a1およびCyp17a2遺伝子発現調節機構：ウナギにおいて、サケ脳下垂体抽出物（SPE）刺激によって17OHP産生に関わるCyp17a2プロモーターの転写活性が誘導されたが、Cyp17a1プロモーターの活性抑制の証拠は得られなかった。SPEではなく、ウナギ自身のLHを用いる必要が新たに考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）チョウザメ類のMIS産生機構：アムールチョウザメとコチョウザメにおいて強い20β-HSD活性を持つHsd17β12Lを同定したが、卵成熟過程で発現変動はサクラマス、メダカ、ティラピアのような劇的なものではなかった。ウナギ同様に17OHP産生調節によってDHP産生が制御されている可能性も考えられる。そこで17OHP産生に関わるCyp17a1およびCyp17a2についても、卵成熟過程での発現変動も調べることで、チョウザメのDHP産生機構を推定する。さらに、それぞれのプロモーター活性化機構も解析することで、総合的にチョウザメ類のMIS産生調節機構を明らかにする。
２）Hsd17β12L遺伝子ノックアウトの作製：引き続き、メダカホモHsd17β12L変異個体の卵成熟過程および血中DHP量を調べ、Hsd17β12LがDHP産生に必須であるかを調べる。
３）Hsd17β12L遺伝子発現調節機構：サクラマスの培養顆粒膜細胞においてLH刺激とHsd17β12L遺伝子発現との間に介在すると想定される未知因子の候補を選抜した。メダカのオーソログ遺伝子において、卵成熟時に発現誘導されるかどうかを調べ、サクラマスとメダカの間で共通する因子を同定する。同定した因子の中で、メダカHsd17β12L遺伝子プロモーターの活性化に関わっているものを探索する。
４）DHPの前駆体である17OHP産生を制御する、ウナギCyp17a1およびCyp17a2遺伝子のプロモーター解析を継続する。培養ホ乳類細胞系での解析を進めているが、SPEの作用が明確ではないため、新たに組換えウナギLHを作製し、それぞれのプロモーター活性化/抑制化に対する作用を調べる。
５）ウナギ、サクラマス培養細胞へのバキュロウイルス遺伝子導入系の開発を、新たに作製したRFP強制発現バキュロウイルスを用いて進める。
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Research Products
(1 results)
