2018 Fiscal Year Annual Research Report
魚類リポカリンタンパク質―性分化機構を中心とした機能の解明
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18H02280
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
大嶋 雄治 九州大学, 農学研究院, 教授 (70176874)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島崎 洋平 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40363329)
北野 健 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 准教授 (40336219)
杣本 智軌 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40403993)
太田 耕平 九州大学, 農学研究院, 准教授 (10585764)
荻野 由紀子 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00404343)
鵜木 陽子 (加藤陽子) 九州大学, 農学研究院, 技術専門職員 (10380560)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リポカリンタンパク質 / アルファ1酸性グリコプロテイン / オス化 / ノックアウト / ストレス / TBT-binding protein |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) TBT-bp2KO XXメダカで発生、成長を調べた結果、配合飼料では肝臓肥大が見られる傾向があった。またXXオスが数パーセント出現し性転換が起きた。2) 本年度は、TBTbp2ノックアウト個体を約二週間コルチゾル処理し、このXX個体における雄化率を生殖腺の組織学的観察により調査した。その結果、約３３％の個体が雄化していることが判明した（対照区の雄化率は約１９％）。したがって、このノックアウトXX個体は、コルチゾルにより雄化しやすい傾向にあることが示唆された。
3) 魚病細菌（A. hydrophila, E. tarda, V. anguillarum）および寄生虫（白点虫：I. multifilii）を野生型メダカに暴露し、2週間観察したが感染症状や斃死はみられなかった。さらに多くの病原体や菌株を入手し、メダカに感染性を示す病原体の選定や病原体を暴露する時間等を検討する必要がある。薬物（トリブチルスズ、トリクロサン、ジアゼパム）をTBT-bp2KOメダカに暴露した結果、その耐性が大きく低下し、遺伝子発現もKOにより影響を受けていることが解明された。
4) Medaka β-actin遺伝子promoterを用いて、TBT-bp2 cDNAをGFPとの融合タンパク質として構成的に発現するトランスジェニックメダカ系統（beta-act/TBTbp2-GFP）を作出中である。
5) 養殖魚のマダイ、マサバ、水産資源対象種 のカタクチイワシ、及び性転換モデルのホシササノハベラより、肝臓のサンプルを採取した。現在、RNAseqによるTBTbp2の発現の有無と雌雄差について解析中である。また、これらの魚種については既読の部分ゲノム情報からTBTbp2の配列を検索した結果、それぞれ相同性の高い部分配列を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度研究を実施して以下の問題点が起こったので対応して行く。1)TBT-bp1KOメダカは生存率が低く、KO系統の確立がまだできていない。来年再度取り組み、その発生、成長、性分化への影響を解明する予定である。
2) 性決定に関する研究はほぼ予定通り研究が進んでいる。
3) 魚病細菌にメダカが感染しなかったので、有害化学物質で実験を行った。
4) Over-expressionによるTBT-bp２の性決定機構に果たす機能解析、ノックインメダカ系統に現れた表現型のレスキュー実験に使用する。
5) RNAseqの解析に時間がかかっている。また、以前に行ったマダイのRNAseq解析の結果からはTBTbp2に相同の配列が含まれていなかったことから、今後データ量を増やしてRNAseq解析する、及び、QPCR等で定量解析することが有効であると予想される。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) TBT-bp1KOによる発生、性分化、性成熟、成長への影響と網羅的遺伝子発現解析を行う。
2) 来年度は、他の雄化誘導物質（エストロゲン合成阻害剤等）を使って雄化を誘導し、ノックアウトXX個体の雄化率を調査する。
3) beta-act/TBTbp2-GFP系統個体での性転換率をDmyによる遺伝型および二次性徴発現や生殖腺の組織学的解析による表現型から解析する。
4) 野生型メダカとTBTbpKOメダカを用いて感染実験を行う。野生型メダカとTBTbpKOメダカで斃死率に差がみられる場合、病原体感染後の肝臓や体表といった組織からRNAを精製し、RNAseq解析によって発現遺伝子を比較する。
5) 今後、各魚種においてTBTbp2の完全長配列の取得を試みるとともに、雌雄での発現パターンの違いを明らかにする。さらに、餌止め、性転換、密度、魚病感染などの生理状態の違いによる発現パターンの解析を進めていく予定である。（マダイの魚病感染サンプルについては愛媛大学清水園子准教授、Tapas Chakraborty助教に協力をお願いしている）
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Research Products
(2 results)
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[Presentation] TOXICITY OF TRIBUTYLTIN AND TRICLOSAN IN TRIBUTYLTIN-BINDING PROTEIN 2 KNOCKED-OUT MUTANT STRAIN OF JAPANESE MEDAKA, ORYZIAS LATIPES2019
Author(s)
Yuji Oshima, Takumi Takamura, Shintaro Enoki, Yoko Kato-Unoki, Yosuke Nagano, Masato Kinoshita, Takeshi Kitano, Ik Joon Kang, Xuchun Qiu, Yohei Shimasaki
Organizer
9th International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology
Int'l Joint Research
