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2019 Fiscal Year Annual Research Report

家畜病原性原虫ネオスポラの感染による流産発症機構の解明

Research Project

Project/Area Number 18H02335
Research InstitutionObihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine

Principal Investigator

西川 義文  帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (90431395)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords原虫 / ネオスポラ / 流産 / 病原性
Outline of Annual Research Achievements

農場経営を進める上で病原性原虫ネオスポラの感染による流産に注意する必要がある。しかしネオスポラに対するワクチンや治療薬は実用化されていないため、ネオスポラ誘発性流産の発症メカニズムの理解に基づく防御方法の開発が必要とされる。そこで、「原虫由来の流産誘発因子が存在し、妊娠子宮での環境を変化させることで胎盤の炎症、壊死が誘発され流産が起こる」という仮説を立てた。本研究では、感染マウスの流産モデルを確立し、原虫側および宿主側の流産誘発因子の特定を行い、その証明を試みる。ネオスポラの流産誘発因子の同定および流産発生のメカニズムの解明は、ワクチンを含めた流産の予防法の開発において極めて重要な科学的知見を提供することができ、本疾病対策へ大きく貢献できる。これまでに以下の項目を明らかにした。
【妊娠期感染モデルの確立およびその病態解析】ネオスポラ感染マウスの妊娠期モデルを確立し、流産あるいは異常妊娠発症時における免疫応答および組織学的変化を病理組織学的に解析した。本感染モデルにおいて、ネオスポラ感染による流産及び胎児異常が確認され、病理組織学的検索により子宮胎盤組織における炎症が確認された。
【原虫由来流産誘発因子のスクリーニング】過剰な炎症反応の惹起や炎症性細胞の遊走に影響を与える宿主遺伝子の発現を増強させるネオスポラ分子をルシフェラーゼアッセイ法により同定した。
【流産誘発因子破壊原虫の作製とin vitroでの性状解析】スクリーニングした原虫因子を流産誘発因子の候補とし、「CRISPR-Cas9によるネオスポラの遺伝子編集技術」を用いて当該遺伝子を破壊した原虫を作製した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

【妊娠期感染モデルの確立およびその病態解析】C57BL/6マウスとBLAB/cマウスを用いて、ネオスポラの妊娠期感染による妊娠・出産の影響を解析した。原虫の感染数と感染させる妊娠期を検討したところ、C57BL/6マウスの妊娠3日目に100万個原虫を感染させると流産や胎児異常が80%の割合で認められた。病理組織学的検索の結果、前述の感染マウスの胎盤組織において炎症が認められた。妊娠13日目に前述の感染マウス及び非感染マウスの胎盤及び脾臓を採材し、リアルタイムPCRによるmRNA発現の相対比較を行った。胎盤組織ではネオスポラの感染により炎症性サイトカインのIFN-g及び各種ケモカイン(CCL2, CCL8, CXCL9)の発現が増加していた。一方脾臓組織では、原虫の感染により炎症性サイトカインTNF-αの発現が現象し、ケモカインCCL9の発現が増加していた。

【原虫由来流産誘発因子のスクリーニング】過剰な炎症反応の惹起や炎症性細胞の遊走に影響を与える宿主遺伝子の発現を増強させるネオスポラ分子をルシフェラーゼアッセイ法によりスクリーニングし、候補分子としてNcGRA7を同定した。

【流産誘発因子破壊原虫の作製とin vitroでの性状解析】NcGRA7を流産誘発因子の候補とし、「CRISPR-Cas9によるネオスポラの遺伝子編集技術」を用いて当該遺伝子を破壊した原虫とNcGRA7-FLAG融合タンパク質発現原虫を作製した。THP1(単球細胞株)を用いて免疫反応を解析し、NcGRA7破壊株では免疫活性化能と細胞毒性(アポトーシス誘導)の低下が認められた。以上の結果より、NcGRA7は炎症反応の誘導に伴う組織障害に関与していることが推測される。

Strategy for Future Research Activity

【流産誘発因子破壊原虫を用いたマウス感染実験による妊娠期の病態解析】活性が確認された原虫因子について、その原虫因子破壊株を非妊娠雌マウスへ感染させ、マウスの生存率と組織の病理組織学的、免疫組織化学的解析を実施し、野生型原虫の感染での結果と比較することで、遺伝子破壊による原虫の病原性の変化を解析する。
【流産誘発因子と相互作用する宿主因子の同定】FLAGタグ融合原虫因子を遺伝子欠損原虫へ導入した原虫株を作製する、この原虫株を栄養膜細胞の細胞株へ感染させ、そのライセートをFLAGタグ抗体で免疫沈降し、質量分析(MALDI-TOF-MSあるいはnanoLC-MS/MS)により結合タンパク質を同定する。
【ネオスポラ流産牛の組織サンプルを用いた流産誘発因子および宿主因子の同定】
以上の研究課題により同定された原虫由来流産誘発因子と宿主因子について、ネオスポラ流産牛の組織サンプル(胎盤、流産胎児等)における発現を確認する。

  • Research Products

    (20 results)

All 2020 2019 Other

All Int'l Joint Research (4 results) Journal Article (9 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Peer Reviewed: 9 results,  Open Access: 4 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results) Remarks (3 results)

  • [Int'l Joint Research] モンゴル生命科学大学(モンゴル)

    • Country Name
      MONGOLIA
    • Counterpart Institution
      モンゴル生命科学大学
  • [Int'l Joint Research] マヒドン大学(タイ)

    • Country Name
      THAILAND
    • Counterpart Institution
      マヒドン大学
  • [Int'l Joint Research] South Valley University/Mansoura University(エジプト)

    • Country Name
      EGYPT
    • Counterpart Institution
      South Valley University/Mansoura University
  • [Int'l Joint Research] University of the Philippines Cebu/Cebu Technological University/University of the Visayas(フィリピン)

    • Country Name
      PHILIPPINES
    • Counterpart Institution
      University of the Philippines Cebu/Cebu Technological University/University of the Visayas
  • [Journal Article] Seroepidemiological study of Toxoplama gondii in small ruminants (sheep and goat) in different provinces of Mongolia.2020

    • Author(s)
      Pagmadulam B, Myagmarsuren P, Yokoyama N, Battsetseg B, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      Parasitol Int.

      Volume: 74 Pages: 101996

    • DOI

      10.1016/j.parint.2019.101996

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Metacytofilin is a potent therapeutic drug candidate for toxoplasmosis.2020

    • Author(s)
      Leesombun A, Iijima M, Umeda K, Kondoh D, Pagmadulama B, Abdou AM, Suzuki Y, Ohba S, Isshiki K, Kimura T, Kubota Y, Sawa R, Nihei C, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      J Infect Dis.

      Volume: 221 Pages: 766-774

    • DOI

      10.1093/infdis/jiz501

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Transcriptome analysis of the effect of C-C chemokine receptor 5 deficiency on cell response to Toxoplasma gondii in brain cells2019

    • Author(s)
      Kobayashi K, Umeda K, Ihara F, Tanaka S, Yamagishi J, Suzuki Y, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      BMC Genomics.

      Volume: 20 Pages: 705

    • DOI

      10.1186/s12864-019-6076-4

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Specific increase of Fusobacterium in the faecal microbiota of neonatal calves infected with Cryptosporidium parvum.2019

    • Author(s)
      Ichikawa-Seki M, Motooka D, Kinami A, Murakoshi F, Takahashi Y, Aita J, Hayashi K, Tashibu A, Nakamura S, Iida T, Horii T, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 9 Pages: 12517

    • DOI

      10.1038/s41598-019-48969-6

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Isolation and characterization of antiprotozoal compound-producing Streptomyces species from Mongolian soils.2019

    • Author(s)
      Pagmadulam B, Tserendulam D, Rentsenkhand T, Igarashi M, Sawa R, Nihei CI, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      Parasitol Int.

      Volume: 74 Pages: 101961

    • DOI

      10.1016/j.parint.2019.101961

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Involvement of Toll-like receptor 2 in the cerebral immune response and behavioral changes caused by latent Toxoplasma infection in mice.2019

    • Author(s)
      Ihara F, Tanaka S, Fereig RM, Nishimura M, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      PLoS One.

      Volume: 14 Pages: e0220560

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0220560

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Molecular screening approach to identify protozoan and trichostrongylid parasites infecting one-humped camels (Camelus dromedarius).2019

    • Author(s)
      El-Alfy ES, Abu-Elwafa S, Abbas I, Al-Araby M, Al-Kappany Y, Umeda K, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      Acta Trop

      Volume: 197 Pages: 105060

    • DOI

      10.1016/j.actatropica.2019.105060

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Endemicity of Toxoplasma infection and its associated risk factors in Cebu, Philippines.2019

    • Author(s)
      Ybanez RHD, Busmeon CGR, Viernes ARG, Langbid JZ, Nuevarez JP, Ybanez AP, Nishikawa Y
    • Journal Title

      PLoS One.

      Volume: 14 Pages: e0217989

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0217989

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Ethanol Extracts from Thai Plants have Anti-Plasmodium and Anti-Toxoplasma Activities In Vitro.2019

    • Author(s)
      Leesombun A, Boonmasawai S, Nishikawa Y.
    • Journal Title

      Acta Parasitol.

      Volume: 64 Pages: 257-261

    • DOI

      10.2478/s11686-019-00036-w

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 妊娠期トキソプラズマ感染の病態発症機序の解明2019

    • Author(s)
      西川義文
    • Organizer
      第27回分子寄生虫学ワークショップ/第17回分子寄生虫・マラリア研究フォーラム合同大会
  • [Presentation] Toxoplasma gondii conducts NFκB pathway of host cells, dense granule protein 14 is a novel member of the orchestra2019

    • Author(s)
      Fumiaki Ihara, Kosuke Umeda, Masahiro Yamamoto, Yoshifumi Nishikawa.
    • Organizer
      第18回あわじ感染と免疫国際フォーラム
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Neospora caninum dense granule protein 7 regulates pathogenesis of neosporosis by modulating host immune response.2019

    • Author(s)
      西川義文、下田直美、Ragab Fereig、森高智弥、梅田剛佑、西村麻紀、猪原史成、小林薫、檜森結羽、鈴木穣、古岡秀文
    • Organizer
      第162回日本獣医学会学術集会
  • [Presentation] Effect of metacytofilin against Toxoplasma gondii.2019

    • Author(s)
      Arpron Leesombun、飯島正富、梅田剛佑、近藤大輔、Baldorj Pagmadulam、Ahmed Abdou、鈴木穣、大庭俊一、一色邦夫、木村智之、久保田由美子、澤竜一、二瓶浩一、西川義文
    • Organizer
      第162回日本獣医学会学術集会
  • [Remarks] 帯広畜産大学・原虫病研究センター

    • URL

      http://www.obihiro.ac.jp/~protozoa/index.html

  • [Remarks] 帯広畜産大学・原虫病研究センター・生体防御学分野・西川研究室

    • URL

      https://sites.google.com/site/nishihdlab/

  • [Remarks] 帯広畜産大学

    • URL

      https://www.obihiro.ac.jp

URL: 

Published: 2021-12-27  

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