2020 Fiscal Year Annual Research Report
新規網羅的病原遺伝子同定法を用いたビブリオ・バルニフィカス好中球逃避機構の解明
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18H02350
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
柏本 孝茂 北里大学, 獣医学部, 准教授 (50327459)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 新規病原遺伝子同定法 / 好中球逃避機構 / 網羅的同定 / 人食いバクテリア / 好中球 / ビブリオ / バルニフィカス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
V. vulnificusは感染者体内で極めて短時間内に増殖・拡散し、感染者を敗血症に陥れ、死に至らしめる。医療機関を受診する時点で既に感染者体内での菌数は相当量に達しているため、抗生物質治療も功を奏さないケースが多い。そのため、依然、致死率は50％以上と高いままである。
我々の研究グループでは、前年度、0055および0056の欠損により、ペリプラズム領域に存在する分子シャペロンGroELの量的減少がもたらされることを明らかにした。グラム陰性菌において、GroELは菌体外膜小胞のマーカーとして使用されていることから、菌体外膜小胞の産生量の変化や質的変化に着目し、それらとV. vulnificusの持つ好中球逃避機構との関係に着目し、研究を進めている。すなわち、0055や0056欠損株は、好中球の貪食を受けやすくなっていることから、V. vulnificusは、感染者体内で菌体外小胞を菌体外に分泌し、それらを遊走して来た好中球に貪食させることにより自らが貪食される効率を抑えるのではないかとの仮説を立てた。現在、野生株、0055あるいは0056の欠損株やその相補株からそれぞれ、菌体外膜小胞を精製することに成功している。今後は、好中球からの貪食を受けやすくなっている0055と野生株から精製した菌体外膜小胞を混合し、好中球と共培養することで、好中球に対する貪食抵抗性が増すか否かを解析する。また、この仮説が違っていた場合を考慮し、0055が認識する物質をプルダウンアッセイにより同定する試みも並行して行う。
加えて、宿主体内での好中球逃避機構を解析する地盤として、0055や0056変異株と同様のISLAP法で取得した化学走化性変異株を用い、感染局所における好中球からの逃避に化学走化性が重要であることを明らかにした。同様の研究手法を0055や0056欠損株に適用し、感染過程のどの段階で0055が必要とされるのかを解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
0055および0056の欠損により、ペリプラズム領域に存在する分子シャペロンGroELの量的減少がもたらされることを明らかにした。グラム陰性菌において、GroELは菌体外膜小胞のマーカーとして使用されていることから、現在、菌体外膜小胞の産生量の変化や質的変化に着目し、それらとV. vulnificusの持つ好中球逃避機構との関係に着目して研究を進めている。仮説として、V. vulnificusは、感染者体内で菌体外小胞を菌体外に分泌し、それらを遊走して来た好中球に貪食させることにより自らが貪食される効率を抑えるのではないかと考えている。この可能性を検討するため、野生株、0055あるいは0056の欠損株やその相補株からそれぞれ、菌体外膜小胞を精製し、電子顕微鏡で確認した。今後は、好中球からの貪食を受けやすくなっている0055と野生株から精製した菌体外膜小胞を混合し、好中球と共培養することで、好中球に対する貪食抵抗性が増すか否かを解析する。また、この仮説が違っていた場合も考慮し、0055が認識する物質をプルダウンアッセイにより同定する試みも並行して行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、好中球からの貪食を受けやすくなっている0055と野生株から精製した菌体外膜小胞を混合し、好中球と共培養することで、好中球に対する貪食抵抗性が増すか否かを解析する。また、この仮説が違っていた場合も考慮し、0055がV. vulnificus菌体内で認識する物質をプルダウンアッセイにより同定する試みも並行して行う。この研究を実施するため、0055タンパク質にヒスチジンタグを付加した0055-Hisタンパクを作製した。これを大腸菌で発現させ、精製することに成功している。これとV. vulnificusの菌体破砕物を混合して、プルダウンアッセイを行い、質量分析計により解析を行う予定である。
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