2019 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類減数分裂における相同染色体間の結合を確立する仕組み
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18H02353
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
李 智博 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (50372660)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / コヒーシン / 精母細胞 / 相同染色体 / 対合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，姉妹染色分体の接着を担うコヒーシンの研究により，減数分裂の染色体分離を制御する分子メカニズムの概要はわかってきたが，減数分裂において相同染色体がどのようにお互いを認識し，結合を確立するか，そのメカニズムは解明されていない。本申請課題では，申請者が発見したRAD21LとREC8の2種類の減数分裂特異的コヒーシンサブユニットに着目して，相同染色体間の結合の分子基盤を明らかにすることを目的としている。
本年度は，連携研究者との共同研究により昨年度に作製した２種類の遺伝子改変マウス（Rec8-3×Flag KIマウス，Rad21L-3×Flag KIマウス）において，RAD21L, REC8のコヒーシンサブユニットに3×FLAGタグが付加された状態で発現することをウェスタンブロット法により確かめた。また，蛍光免疫染色法により，3×FLAGタグの付加がどちらのタンパク質の局在にも影響を及ぼさないことも確かめた。さらに，抗FLAG抗体を使用した免疫沈降により，REC8-3×FLAGもRAD21L-3×FLAGも他のコヒーシンサブユニットが共免疫沈降されること検査し，タグ付加によりコヒーシンタンパク質複合体の形成にも影響がないことを確かめた。上記のことを確認後，REC8-3×FLAGについては，抗FLAG抗体を使用した共免疫沈降物の質量分析解析により，REC8と相互作用するタンパク質の候補を複数同定してきている。しかし，RAD21L-3×FLAGについては，免疫沈降による精製段階にまだ問題が残るため，質量分析による共免疫沈降物の同定にまでは至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウス系統の確立のための交配などに時間と労力がかかったことと，免疫沈降物の精製度を高めるための条件検討を行うために時間がかかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，抗3×FLAG抗体を作製し，RAD21L-3×FLAGの免疫沈降法による共免疫沈降物の精製とその後の質量分析による同定を試みる。また，抗FLAG抗体あるいは抗3×FLAG抗体を使用してノックインマウスの精巣からコヒーシン複合体を精製し，電子顕微鏡によりRAD21LあるいはREC8を含むコヒーシン複合体の構造を観察し，比較する。また，全ゲノムクロマチン免疫沈降シークエンス法により，ゲノム上の2種類のコヒーシンタンパク質の局在位置の特定を試みる。
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