2018 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of maternal-derived epigenetic modifications essential for mammalian development
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18H02355
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
尾畑 やよい 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70312907)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
樋浦 仁 東北大学, 医学系研究科, 助教 (70451523)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 卵子形成過程 / エピジェネティクス / 胚発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題を達成するにあたり、2018年度は、卵母細胞特異的遺伝子ノックダウン法を確立した。まず、人工マイクロRNA（amiRNA）を卵母細胞特異的に発現させるホスト遺伝子としてZp3を選別した。Zp3が非成長期卵母細胞からフルサイズの卵母細胞まで高発現していることも確認した。次いで、Zp3遺伝子のイントロン内にamiRNAを挿入するためのガイドRNAを3種類設計し、受精卵におけるゲノム編集効率を解析した。いずれのガイドRNAも高い編集効率を示した。そこで、GFPに対するamiRNA（既報の配列）の両端に、Zp3のゲノム編集部位の上流および下流相同配列をそれぞれ付加した。GFPを恒常的に発現するトランスジェニックマウス（GFPマウス）より受精卵を採取し、この受精卵に、ガイドRNA、amiRNAおよびCas9タンパクを導入しノックインマウスを得た。GFP陽性かつamiRNAがノックインされたマウスの卵母細胞で緑色蛍光シグナルを測定したところ、GFPマウスのコントロール卵母細胞と比較してシグナル強度は大幅に減衰し、野生型マウスの卵母細胞と同程度となった。これに対し、卵母細胞を覆う卵丘細胞や顆粒膜細胞では、ノックインマウスとGFPマウスで緑色蛍光シグナルの強度に差はなく、強いGFPが観察された。以上より、Zp3のイントロン領域にamiRNAを導入することで、卵母細胞特異的な遺伝子ノックダウンシステムを構築することができた。続いて、ノックダウンの標的遺伝子として内在性のDnmt3lやKdm1bに対するamiRNAを2種のアルゴリズムで設計した。設計したamiRNAを発現ベクターのイントロンに導入し、ES細胞にトランスフェクションした。その結果、一方のアルゴリズムで設計したもののみノックダウン効果が認められた。今後、これらのamiRNAを導入したマウス系統を樹立し、解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
卵母細胞特異的遺伝子ノックダウン法を確立するために、今回、GFPマウスを使用した。このGFPマウスでは、ニワトリアクチン遺伝子（CAG）プロモーターでGFP遺伝子が転写されるため、発現量が非常に高い。従って、高発現しているGFPを卵母細胞特異的に消失させることに成功した点、また、成長初期の卵母細胞でも成長が完了した卵母細胞でも同様に高いノックダウン効果が観察できた点などは、予想以上の結果が得られたと考えている。一方、内在性遺伝子を標的としてamiRNAを設計する際には、予期せぬオフターゲット効果も考えられ、これについては、今後検証して行く必要が残された。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNMT3LはDNAのメチル化を触媒する直接的な活性を持たないが、新規DNAメチル基転移酵素DNMT3Aの補酵素として働き、生殖細胞のDNAメチル化に不可欠である。これらの知見は、既に、ノックアウトマウスの解析から得られている。今後は、Dnmt3lに対するamiRNAのオフターゲット解析を行う。まずは、ES細胞でオフターゲット解析を行った後、amiRNAノックインマウスを作製し、その卵母細胞のDNAメチル化型およびトランスクリプトームを解析する。得られた結果をDnmt3lノックアウトマウスのそれらと比較する他、オフターゲットスコアが高く、卵母細胞で発現するコード遺伝子の発現をwestern blotingで解析し、オフターゲットの影響を評価する。
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[Journal Article] Association of four imprinting disorders and ART2019
Author(s)
Hattori H, Hiura H, Kitamura A, Miyauchi N, Kobayashi N, Takahashi S, Okae H, Kyono K, Kagami M, Ogata T, Arima T.
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Journal Title
Clin Epigenetics
Volume: 11
Pages: 21
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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