2019 Fiscal Year Annual Research Report
Developmental analysis of xenogenic germ cells using blastocyst complementation
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18H02367
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 俊寛 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 助教 (20587414)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9法 / ノックインラット / ノックアウトラット / Prdm14遺伝子 / 始原生殖細胞 / 精巣 / 卵巣 / H2BVenus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生殖細胞のみを欠損するPrdm14/KOラットおよびPrdm14-H2BVenus/KIラットの交配により得た胚盤胞にラットES細胞を顕微注入し、補完された精巣ならびに卵巣を形態的・組織学的に解析した。
まず、Prdm14-H2BVenus/KI♂ヘテロ (Prdm14-Venus/+) とPrdm14/KO ♀ヘテロ (Prdm14-mut/+) の交配によって得られた4.5日目胚盤胞のうち、生殖細胞欠損個体 (Prdm14-Venus/mut) が現れるVenus陽性胚盤胞のみを収集した。この胞胚腔にtdTomato蛍光遺伝子を導入したラットES細胞 (XX-ES及びXY-ES) を顕微注入する胚盤胞補完を施し、偽妊娠誘起したレシピエントラットの3.5日目子宮角に移植した。5日後にキメラエピブラストを回収してXX-ESおよびXY-ES細胞に由来する蛍光の有無を調べたところ、始原生殖細胞形成予定領域にtdTomato陽性細胞の局在が認められた。胚盤胞補完で作出したキメラ産仔はES細胞のみに由来するtdTomato陽性の生殖巣を持ち、補完キメララットと野生型ラットとの交配によって得られたG1世代は100％、ES細胞に由来するtdTomato陽性産仔だった。また、「性」ミスマッチキメラ (XX-ES補完の雄キメラおよびXY-ES補完の雌キメラ) の生殖巣を免疫組織染色したところ、Vasa陽性細胞が散見された一方、成熟生殖細胞は確認できなかった。
以上の結果は、迅速かつ効率的な遺伝子改変ラット作製システムの確立に寄与すると期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生殖細胞のみを欠損したPrdm14/KOラット、ならびに始原生殖細胞 (PGC) から精子(変態前)・卵子を含む生殖細胞の動向をH2BVenusの発現を指標にして追跡できるノックインラットを作製し、PGCの出現から性決定までの動向をラットにおいて初めて明らかにした。この結果は2020年2月、Development誌に発表した。また、Prdm14-Venus/mut胚盤胞を遺伝子改変したラットES細胞で補完したところ得られたキメラの子孫はすべて遺伝子改変ラットであり、迅速かつ効率的な遺伝子改変ラット作製システムのホスト胚盤胞として有用なことを証明できた。よって、「おおむね順調に進展している」と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
Prdm14-Venus/mutラット胚盤胞にマウスES細胞を使って異種胚盤胞補完し、キメララット個体の精巣および卵巣におけるマウスES細胞由来生殖細胞の有無、ならびにそれら生殖細胞の受精能・発生能をin vitroおよびin vivoで評価する。また、これまでに50匹もの♂キメララットを作製しても生殖寄与能力を確認できなかったES細胞ラインを用い、Prdm14/KOラット胚盤胞を補完することで不寄与ES細胞の生殖細胞寄与能を解析する。
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