2018 Fiscal Year Annual Research Report
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18H02370
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
三嶋 雄一郎 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (00557069)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲田 利文 東北大学, 薬学研究科, 教授 (40242812)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / コドン / リボソーム / tRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、６１種類のコドンによって指定されている。本研究では、ゼブラフィッシュ胚をモデルとして、コドンによるmRNA安定性制御の普遍性と時空間的な可変性を検証することにより、コドンによる遺伝子発現制御のダイナミズムを個体レベルで明らかにすることを目的としている。本年度は、ゼブラフィッシュ初期胚においてコドン効果を検証するための準備として、コドンレポーターDNAを、胚ゲノムの決まった位置に高効率で挿入するための系統を樹立した。得られた系統のうち、実験に使用できる候補について、挿入箇所の同定を進めているところである。まだ挿入部位の同定には至っていないが、インバースPCRによって挿入箇所を含むと思われる断片を得ている。またゼブラフィッシュに存在するtRNA修飾酵素の発現解析を行い、いくつかのtRNA修飾酵素が初期胚において実際に動的に発現変動することが確認された。その中で特に特徴的な発現パターンを示した数種類について、CRISPR-Cas9によるゲノム編集による変異系統の作成を進めている。またtRNAの全体の発現量についても解析を行い、受精後の母性―接合子遷移期（Maternal-to Zygotic Transition; MZT）において、tRNAの量が全体的に増加することを見出した。この増加は、MZTにおいてRNAポリメラーゼIIIによる新規転写が活性化したためであることを示すデータを得ている。この結果はtRNAのダイナミックな発現変動が実際にゼブラフィッシュ初期胚で起こっていることを意味しており、本研究の中心仮説であるコドンによるmRNA安定性制御の可変性を考える上で重要な知見である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、研究代表者が開発した61センスコドンがmRNAの安定性に及ぼす影響を一括して定量できる実験系 (以下 Parallel Analysis of Codon Effects ; PACE法と呼ぶ) を応用し、細胞分化が進んだ後期胚において、コドンがmRNAの安定性に及ぼす影響を検証することを目的としている。初年度はまず、PACE法に用いるコドンレポーターDNAを、胚ゲノムの決まった位置に高効率で挿入するための実験系の構築を行った。 そのために、DNA組換え酵素PhiC31インテグラーゼの標的配列と、マーカーとしてアクチンプロモーターで制御されるDsRedを、Tol2トランスポゾン法によってゼブラフィッシュゲノム中にランダムに挿入した系統を複数樹立した。得られた系統を掛け合わせ、DsRedの蛍光から挿入部位が1箇所でかつ挿入部位に依存した転写制御を受けないと考えられた系統について、現在挿入箇所の同定を進めている。またコドンがmRNAの安定性に与える影響の可変性を検証するために、ゼブラフィッシュに存在するtRNA修飾酵素の発現解析を行った。その中で、初期胚において発現しているものに関してはCRISPR-Cas9によるゲノム編集による変異系統の作成を進めているところである。すでに複数の遺伝子に関して、変異を持つ第一世代の系統が得られつつある。以上の状況から、研究は当初の計画に沿って順調に進んでいると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まずPhiC31インテグラーゼの標的配列の挿入部位を決定する必要がある。挿入部位が決まり次第、コドンレポーターライブラリを組み込んだ系統の作成に取り掛かる予定である。またtRNA修飾酵素の変異体作成と並行して、それぞれのtRNA修飾が発生時期や組織によってどの程度変動するかを生化学的に検証していく。そのために、APBゲルを用いたノザンブロッティングや、質量分析による解析のための条件検討を進める。同時に、コドンに依存したmRNA安定性の変化が、同じく翻訳を共役して起こる品質管理機構と独立であるかどうかを胚発生過程において見分けるために、その過程に関わる因子のゼブラフィッシュおよび出芽酵母の変異体（Hel2/Znf598、Not4/Cnot4）を用いた解析系の確立にも取り組んでいく。また、検出されたコドン効果が翻訳依存的であるかを検証するために、既存のモルフォリのアンチセンスオリゴを用いたアプローチに加え、翻訳開始の阻害剤であるRocAを用いた実験を行う。RocAに関してはゼブラフィッシュでの使用例がほとんどないため、条件検討から進めていく必要がある。また近年、一部のリボソームタンパク質が細胞や組織によって発現が異なる可能性（Ribosome heterogeneity）が指摘されている。そこで、ゼブラフィッシュ初期胚において特異性を示す可能性があるリボソームタンパク質を、in situハイブリダイゼーションやqRT-PCRを用いた発現解析によって検索する実験を行う。
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