2018 Fiscal Year Annual Research Report

Tudorドメイン蛋白質群が関与するpiRNA生合成経路の解明

Research Project

Project/Area Number	18H02375
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	甲斐歳恵大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (40579786)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	piRNA / Tudor domain / ピンポン増幅 / トランスポゾン / 生殖細胞
Outline of Annual Research Achievements	Tdrd5変異体におけるpiRNA生合成異常の解析：前年度、Aubに積み込まれている成熟piRNA、およびプロセシング中間体を、対照の野生型とTdrd5変異体の卵巣粗抽出液から精製し、次世代シーケンシングによって解析した。結果は良好で、インフォマティクス解析を終えた。複合体の形成機構の解析：前年度の遺伝学的解析から、Tdrd5とTdrd9、KrimとAgo3が４量複合体を形成しうることを見出し、生化学的手法による検証を行なった。また、Tdrd5がpiRNAプロセシングのどのステップに必要なのかを同定するために、現在、さらに詳細にプロセシング機構を解析し、上流で機能しているVasaヘリカーゼとSpnEヘリカーゼの機能解析を開始した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成30年後期、piRNAの解析（Ago3）の工程で、当初の予想に反し、Ago3の免疫沈降の効率に問題があることが判明し、異なる抗体や蛋白質を用いた解析手法の検討が必要になった。その結果、piRNAの解析（Ago3）手法の検討およびpiRNAの解析（Ago3）の工程のため、遅延が生じることになった。CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集によって、Ago3にタグを付与した遺伝子改変ショウジョウバエを作成し、そのタグを用いた免疫沈降法によって結合RNAを精製することとした。Tdrd5、また２つのヘリカーゼタンパク質も同様にタグ付きショウジョウバエを作成し、結合RNAおよび結合タンパク質を精製、同定を試みた。
Strategy for Future Research Activity	タグつきタンパク質に対する免疫沈降法によって結合RNAを次世代シーケンシングで解析し、インフォマティック解析によってTdrd5の生化学的活性を明らかにする。また、遺伝学的解析によってTrdr5の上流で機能していることが示唆されている2つのヘリカーゼタンパク質に結合するRNA種を免疫沈降法と次世代シーケンシングによって解析し、それらの生化学的機能を明らかにする。