2019 Fiscal Year Annual Research Report
Microsecond resolved single molecule fluorescence measurements triggered by solution mixing
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18H02382
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
高橋 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ライン型共焦点顕微鏡 / ポリアラニン / ヘリックス・コイル構造転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
独自の一分子蛍光分光法であるライン型共焦点顕微鏡の性能向上につとめ、最速で10マイクロ秒の時間分解能において、最長で10msにわたる一分子蛍光の連続観察を可能とした。さらに、点集光型共焦点光学系に基づいた蛍光測定装置と時間相関単一光子計数ボードを組み合わせ、ナノ秒からマイクロ秒の時間領域におけるタンパク質ダイナミクスの観測を可能にした。また、通常の蛍光相関観測も可能である。これらの実験装置を用いて、以下の研究成果を得た。
F1-ATPaseはATP加水分解に駆動されて回転するタンパク質である。本研究では、F1-ATPaseのβサブユニットのミリ秒以下の構造変化を直接捉えることを試みた。野性型の試料を高ATP濃度において観測したところ、期待されたopen-close型の構造転移は観察できなかった。この過程で、溶液混合装置を用いた観測を行なった。一方で、加水分解の遅いATPアナログであるATPγSを用いたところ、先行研究を再現する結果が得られた。以上の観察から、野性型のF1-ATPaseにおいては、ATPが加水分解された後のリン酸の解離を待つ状態が、酵素反応の律速となることを推論した。
ポリアラニンを蛍光色素で二重ラベル化し、ナノ秒時間領域における蛍光相関分光法を用いて、水溶液中にて76 nsの時定数における構造変化ダイナミクスを観察し、試料のヘリックス・コイル構造転移にアサインした。溶媒の粘度を変化させたところ、時定数が粘度にほとんど依存しなかった。これは、ペプチド鎖のヘリックス形成の遷移状態が溶媒による摩擦の効果を受けにくいことを示唆する結果であり、最近の理論計算に基づく推論を支持する結果である。
細胞内で液滴を作ることが知られているLAF-1について、蛍光色素のラベル化を行い、一分子レベルにおける構造特性を観測した。タンパク質の任意の部位に蛍光色素を化学的に修飾する新しい手法の開発に取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
溶液混合装置を用いたタンパク質構造変化の観測をF1-ATPaseを用いて進めた。研究の主目的である本装置を用いたタンパク質のフォールディング研究を2020年度に実施するべく準備を継続している。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質フォールディング研究のモデルタンパク質の一つであるプロテインLを用いて、溶液混合後の非平衡状態におけるフォールディング過程を観察する。試料のラベル化を終え、平衡状態での観測を進めたのちに溶液混合実験を実施する。
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