2019 Fiscal Year Annual Research Report
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18H02383
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
白木 賢太郎 筑波大学, 数理物質系, 教授 (90334797)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
冨田 峻介 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (50726817)
加納 英明 筑波大学, 数理物質系, 准教授 (70334240)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 液-液相分離 / ドロプレット / タンパク質 / 凝集 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の組み合わせによる液-液相分離の現象を実現し、低分子によって制御できることを確認した。
産業利用を想定した免疫グロブリン（IgG）とポリアミノ酸とを混合する溶液系での液-液相分離について、モノクローナル抗体であるオマリズマブを対象とした実験系へと展開して、論文を投稿にいたった。概要は次のようになる。IgGとポリグルタミン酸（polyE）とを混合するとポリイオンコンプレックス（PPC）を形成する。このPPCを形成すると、適切なpolyE濃度の場合、高濃度のタンパク質溶液の粘度が劇的に低下するのである。具体的には150 mg/mLのオマリズマブだけの溶液では90 cPと高粘度を示すが、20-50 mM polyEを添加するとPPCを形成して粘度が10 cPになる。PPCから解離させたオマリズマブは構造が変化せず凝集も増えないので、高濃度溶液製剤として利用できると考えられる。
酵素の連続反応について、次のような研究成果をあげた。まず、ATPとポリリシンによる液滴の形成に成功し、これを足場としてヘキソキナーゼが液滴に取り込まれることを明らかにした。さらに、ATPはヘキソキナーゼによってADPへと分解され、その結果、ATPポリリシン液滴が溶解することも明らかになった。さらに、ヘキソキナーゼがグルコースをグルコース6リン酸へと変換した。この反応にともない、ATPポリリシン液滴が溶解することがわかった。次の反応として、グルコース6リン酸が分解されるにともない、NADPHが合成され、NADPHポリリシン液滴が形成することがわかった。この液滴にはグルコース６リン酸脱水素酵素が取り込まれて別の液滴を形成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、IgGとpolyEによるPPCの系をすでに数本の論文として報告してきたが、本年度は、モノクローナル抗体へと応用することに成功した。さらにPPCの形成によって粘度が大幅に低下すること、PPCから解離させても抗体の変性が見られないことを明らかにし、原著論文としてまとめてJ. Pharm. Sci.に投稿した。
さらに、今年度からスタートした液-液相分離による酵素連続反応についても進展がみられた。２段階の反応が順次、液滴の内部で進むことが再現できた。この結果は論文にまとめてChemRxivに「Dynamic Formation of Liquid Droplets Triggered by Sequential Enzymatic Reactions」というタイトルで投稿した。
また、一連の液-液相分離の低分子による制御を整理し、Biophys Revへ「Effect of Additives on Liquid Droplets and Aggregates of Proteins」というタイトルの総説を寄稿した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、オマリズマブとpolyEによるPPCの粘度低下の成果について、論文のメジャーリビジョンによる応答の追試を行い、論文として公開するよう実験を重ねる。
さらに、今年度スタートしたATPポリリシン液滴を足場とする酵素連続反応について、ChemRxivに寄稿した原著論文をChem Commへと投稿できるように追試をする。具体的には連続反応が進むにつれて液滴の素性がどのように変化するか、定量化が不足しているため、観察系の構築が必要になる。
さらには、初年度に成果の報告をしたオボアルブミンとリゾチームの共凝集・相分離の系について、静電相互作用および疎水性相互作用の寄与を定量し、論文として報告する。
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