2019 Fiscal Year Annual Research Report
新規超解像法を用いて心筋ミオシン集合体内の個々の分子振動運動をとらえる
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18H02408
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
茅 元司 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (00422098)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 心筋ミオシン / 超解像 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018年度の心筋ミオシン１分子計測計測を更に拡張させて，リン酸濃度の変化に対する心筋ミオシンの構造変化を検討した．これまで検証してきたADPのみの条件と，ADPにリン酸を加えた条件の主な違いは，心筋ミオシンが力発生に伴う構造変化（パワーストローク）をする前にアクチンから解離する頻度の差であった．即ち，リン酸の濃度に比例して解離する頻度が上昇した．この結果は，近年議論が分かれているミオシン頭部からのリン酸放出のタイミングが，パワーストローク前であることを示す結果であり，大きな成果となった．一方で超解像イメージングを目的とした金ナノ粒子の散乱像計測では，既製の顕微鏡を利用していたため，対物レンズの僅かな鉛直方向ドリフトによる散乱像の強度揺らぎが問題であることが判明した．そこで，既製品の対物レンズ用の支柱を取り外し，顕微鏡ステージに対物レンズを直接固定し，ステージ自身を鉛直方向に動かす仕組みに変更することで，この問題を解決した．本研究費で購入した高速カメラとこうした改良により，これまで報告されていたレーザー強度の1/4程度の強度で0.5nmの精度での計測が可能となった．また，回折限界内に位置する粒子の散乱像の強度が干渉し合う問題を前年度に報告したが，これを検証するためにガラス面に固定した粒子とミオシンによってガラス面状を移動するアクチンに固定した粒子を同時に計測し，２つの粒子が近づくにつれて散乱強度がどのように変化するか検証した．しかし，２つの粒子間の距離と干渉の度合いに一貫性がなく，距離と干渉の度合いの関連性を定量評価することが出来なかった．本研究で応用する超解像イメージング原理であるMultiple Emitter Localization法は粒子同士の強度が完全に独立である前提で成り立つ理論ゆえに，本研究の結果はこの理論の限界を示している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
２つの粒子の距離が近づくにつれて，これらの粒子の散乱強度が干渉し合いことを定量的に評価するための実験方法の発案，実施に到るまでの時間を要し，また実験実施後の解析から干渉の度合いと粒子間の距離に一貫性が見えず，研究の進行が滞った．この原因は，アクチンに固定した粒子はアクチンの鉛直方向の揺らぎ（~数十nm）によって不規則にその散乱強度を揺らがせるため，２粒子散乱強度の干渉の度合いと粒子間距離の関係をマスクするほど大きなノイズを生んでいたことである．理想的には，金ナノ粒子間の距離をシステマティックに変えて（例えば，200nm，100nmごとに粒子を並べる），ガラス表面に完全に固定することができれば，この検証は可能であると考えたが，その方法が見出せなかった．
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| Strategy for Future Research Activity |
心筋ミオシン１分子実験の解析はほぼ終了したので，今後はこれらの実験データを元にシミュレーションモデルを開発し，このモデルを用いて，心筋ミオシンの１分子特性が分子集団の自律機能，さらには心臓機能にどのように関わっていくのか，検証していく．高速超解像イメージングに向けた検証も引き続き行なっていくが，この手法の限界も合わせて検討していく．
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