2019 Fiscal Year Annual Research Report

Development of single-molecule measurement with angstrom precision

Research Project

Project/Area Number	18H02418
Research Institution	Institute for Molecular Science
Principal Investigator	飯野亮太分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	１分子計測 / 分子モーター / 光学顕微鏡
Outline of Annual Research Achievements	１．金ナノ粒子、銀ナノ粒子は、プラズモン共鳴波長の違いに起因し散乱効率の高い波長が異なる。それぞれの共鳴波長に合わせたレーザー光を用いた二波長全反射暗視野照明光学系、およびDual View光学系を用いた二波長同時検出光学系を開発し、金ナノ粒子と銀ナノ粒子を識別して同時に高速、高精度に１粒子イメージングすることに成功した。様々な観察条件において、金ナノ粒子と銀ナノ粒子の識別能を定量的に検証し、さらに時間分解能と位置決定精度の相関を検証した。２．開発した１分子オングストローム計測法を生体分子モーターに適用した。高分解能の構造情報が得られている腸球菌由来のV1モーターを対象とし、回転運動の詳細な１分子解析を行うことに成功した。１分子解析の結果、１個のATPの加水分解に相当する120°の回転がさらに、40°と80°のより小さな角度の回転（サブステップ）に分離できることを初めて発見した。また、ATP加水分解が遅い変異体を用い、さらに反応生成物のADPを加えた実験では、本来の回転方向（Vo部分からみて反時計回り）とは逆向きに－80°もしくは－40°回転する様子が観察された。回転運動中の停止時間の分布を解析することで、40°サブステップ前の停止では３つ、80°サブステップ前の停止では１つ、合計で４つの時定数が得られ、これらの時定数がATP加水分解反応の４つの素過程（ATPの結合、ATPのリン酸結合の開裂、反応生成物ADPの解離、反応生成物リン酸の解離）に対応することを明らかにした。さらに、１分子解析で得られた結果をX線結晶構造解析による構造情報と組み合わせることで、V1の化学力学共役機構のモデルを提案した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason １．金ナノ粒子と銀ナノ粒子を識別して同時に１粒子イメージングする手法を開発し、生体分子モーターの高速高精度１分子計測に適用することに成功した。２．回転分子モーターV1-ATPaseの回転運動におけるサブステップを発見し、ATP加水分解反応の素過程（ATP結合、加水分解、ADPやリン酸の解離）と力学的回転の対応（化学力学共役）の詳細を明らかにした。
Strategy for Future Research Activity	１．金で表面コートされた銀ナノ粒子をプローブに用いることで、より小さなプラズモニックナノ粒子を用いた高速高精度生体１分子計測を達成する。２．回転分子モーターについて、今後はATPを加水分解するV1部分だけでなく、イオンを輸送するVo部分を含むV-ATPase全体（VoとV1の複合体）を対象とした１分子計測を推進し、エネルギー変換機構、エネルギー変換効率および可逆性についての理解を進める。