ミニマムゲノム細菌を用いた遺伝子機能の網羅的同定による生命の基幹システムの理解

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02433
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 柿澤 茂行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10588669)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細菌ゲノム / 必須遺伝子 / マイコプラズマ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、近年作成された「ミニマムゲノム細菌」を用い、その機能未知遺伝子の機能を網羅的に解明することで、生物にとって必須な基本システムの全容を解明することを目的とする。ミニマムゲノム細菌は必須遺伝子もしくは準必須遺伝子のみを残したゲノムを持つ細菌であり、473遺伝子（531 kbpのゲノム）のみを持つ。しかし驚くべきことに、この473遺伝子のうち149遺伝子（31.5 %）が機能未知遺伝子であることが分かり、細菌が持つ遺伝子の機能についてあまり理解が進んでいない現状が浮き彫りとなった。本研究では、これらの必須かつ機能未知な遺伝子の機能解明を行うことで、生命システムのより深い理解を目指す。
本年度は、効果的な誘導プロモーター系の決定を行った。ミニマムゲノム細菌はほぼすべての遺伝子が必須であり、遺伝子ノックアウトが不可能である。そのため新しいツールが必要とされる。本研究では、狙った遺伝子を特異的にノックダウン（発現抑制）できるCRISPR interference（CRISPRi）の系をミニマムゲノム細菌へと応用することで、必須遺伝子の機能解析を目指すものである。しかし、必須遺伝子が常時ノックダウンされていては菌体の増殖に影響が出るため、発現のオン／オフを行う系が必要となる。そこでミニマムゲノム細菌において利用可能な誘導プロモーター系を複数検討したところ、Tetリプレッサー系を用いたテトラサイクリン誘導プロモーターと、セオフィリン誘導プロモーターを用いたリボスイッチ系が効果的と思われたため、それらの特異性や発現量に加え、非誘導時の発現リーク量などを検証した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

効果的な誘導プロモーター系の確認を行い、Tetリプレッサー系を用いたテトラサイクリン誘導プロモーターと、セオフィリン誘導プロモーターを用いたリボスイッチ系とを比較し、それらの特異性や発現量に加え、非誘導時の発現リーク量などを検証することができ、これにより、ミニマムゲノム細菌において効果的に遺伝子をオン／オフすることが可能となるため、順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今回得られた検証結果を用い、今後はTetリプレッサー系を用いたテトラサイクリン誘導プロモーターを主に使用して研究を推進していく予定である。ミニマムゲノム細菌はほぼすべての遺伝子が必須であり、必須遺伝子が常時ノックダウンされていては菌体の増殖に影響が出るため、発現のオン／オフを行う系が必要となる。そのため、本研究によって得られた成果を活用することで、ミニマムゲノム細菌において効果的に遺伝子をオン／オフする系の確立ができ、今後の機能解析が進展すると期待される。