ミニマムゲノム細菌を用いた遺伝子機能の網羅的同定による生命の基幹システムの理解

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02433
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 柿澤 茂行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10588669)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細菌ゲノム / 必須遺伝子 / マイコプラズマ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、近年作成された「ミニマムゲノム細菌」を用い、その機能未知遺伝子の機能を網羅的に解明することで、生物にとって必須な基本システムの全容を解明することを目的とする。ミニマムゲノム細菌は必須遺伝子もしくは準必須遺伝子のみを残したゲノムを持つ細菌であり、473遺伝子（531 kbpのゲノム）のみを持つ。しかし驚くべきことに、この473遺伝子のうち149遺伝子（31.5 %）が機能未知遺伝子であることが分かり、細菌が持つ遺伝子の機能についてあまり理解が進んでいない現状が浮き彫りとなった。本研究では、これらの必須かつ機能未知な遺伝子の機能解明を行うことで、生命システムのより深い理解を目指す。
必須遺伝子が常時ノックダウンされていては菌体の増殖に影響が出るため、発現のオン／オフを行う系が必要となる。そこでミニマムゲノム細菌において利用可能な誘導プロモーター系を複数検討したところ、Tetリプレッサー系を用いたテトラサイクリン誘導プロモーター系が効果的と思われた。この系と、特異的遺伝子ノックダウン系であるCRISPR interference （CRISPRi）とを組み合わせた系を構築することで、ミニマルセル内において必須遺伝子を狙ったタイミングでオフにすることが可能となり、必須遺伝子であってもその機能を解析することができた。本研究において、いくつかの遺伝子を特異的にノックダウンしたところ、誘導後にターゲットのmRNA量が有意に減少し、加えて細胞の増殖が抑制されることが分かった。これにより、本研究において構築した系が効果的に機能していることが再確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

効果的な誘導プロモーター系の確認を行い、Tetリプレッサー系を用いたテトラサイクリン誘導プロモーター系が有効であることが分かり、この系と特異的遺伝子ノックダウン系とを組み合わせることで、ターゲット遺伝子のmRNA量の減少および、細胞の増殖抑制が確認された。以上のことから、研究は順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今回得られた知見に基づき、同様の誘導プロモーター系と特異的遺伝子ノックダウン系を用いて、ターゲット遺伝子をいくつかの機能未知遺伝子へと拡張する。それにより、必須かつ機能未知な遺伝子をノックダウンした際にどういった細胞応答が起こるかを確認し、機能未知遺伝子の機能に迫る系を構築する。