2018 Fiscal Year Annual Research Report

父性ミトコンドリアの選択的分解を規定する分子基盤とその生物学的意義

Research Project

Project/Area Number	18H02435
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	佐藤美由紀群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (70321768)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	オートファジー / 受精 / 線虫
Outline of Annual Research Achievements	線虫 C.elegans 受精卵において，精子から持ち込まれた父性オルガネラは選択的オートファジー・アロファジーによって分解される．われわれは最近アロファジーにおいて基質選択性を規定するオートファジーアダプターとして働く新たな因子・ALLO-1を同定している．2018年度はALLO-1の上流で標的のユビキチン化に働くユビキチンリガーゼをはじめALLO-1近傍で働くその他アロファジー関連因子の同定を目的に，線虫受精卵を回収し，そこからGFP-ALLO-1と免疫共沈する因子を質量分析により同定した．さらに同定された因子について機能的RNAiによる二次スクリーニングを行い，アロファジーに関与する因子を探索した．しかし，この方法ではアロファジーにはっきりとした影響を与える因子の同定には至らなかった．そこで，クロスリンカー処理により相互作用を安定化させる方法を試みることにし，条件検討を行ったのち質量分析を行った．また，ALLO-1の働きを分子レベルで理解するため，機能領域の同定を試みた結果，N末端領域を介して複数のオートファジー因子と相互作用することが明らかとなった．また，allo-1変異体では，LGG-1（線虫LC3ホモログ）の局在化が起きなくなるが，より上流のオートファジー制御因子の局在化も阻害されていたことから，LGG-1との相互作用以外にも標的オルガネラ特異的なオートファゴソーム膜形成の仕組みが存在し，そこにALLO-1が関与している可能性が示唆される．一方，ALLO-1のC末端領域は父性オルガネラへの局在化を制御していることを明らかにした．また，C末端の配列が異なるアイソフォームが存在し，局在性の傾向が異なることも明らかとなった．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ALLO-1の機能領域の同定は順調に進んでいる．線虫受精卵における質量分析による解析は報告例が少なく，試行錯誤が必要であると予想されていたが，2018年度の結果から条件の絞り込みが進みつつある．
Strategy for Future Research Activity	クロスリンカー処理後の質量分析を条件を変えながら複数回行い，ALLO-1近傍に存在する因子を網羅的に同定する．さらに機能的二次スクリーニングによりユビキチンリガーゼをはじめとする関連因子の同定を行う．また，ALLO-1の機能領域の同定は順調に進んでいるので，さらに領域の絞り込み，生化学的解析，変異体の作製と表現型解析を行い，ALLO-1がどのように基質を認識し，そこにオートファジー因子をリクルートするのか，またそこにIKKE-1がどのように関わるのか，詳細な分子機構を明らかにする．