2020 Fiscal Year Annual Research Report
Global regulatory mechanism of endocytosis revealed by cell-surface imaging technique
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18H02436
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
吉村 成弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / ライブセルイメージング / 細胞骨格 / クラスリン / カベオラ / カベオリン / 高速原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題Ⅱ：各種エンドサイトーシス経路による細胞膜張力調節機構の解明
ポリジメチルシロキサン製ストレッチチャンバを用いた観察から、培養細胞に伸展刺激を加えた場合、クラスリンピットの開口頻度の減少が見られるとともに、閉口過程で小開口の時間の延長が見られた。これらの結果は、開口過程と小開口から閉口へと至る過程に張力依存的機構が存在することを示す。siRNAによるノックダウンの結果、F-BARドメインをもつタンパク質の中でもCIP4が特に開口過程での膜変形へ強く関与していることを明らかにした。同じF-BARドメインを持つSyndapin2とのキメラタンパク質を用いた解析から、その機能が、N末端のF-BARドメインと中央の非構造領域の両方によるものであること、非対称的な膜の隆起には中央部の非構造領域が特に重要であることをつきとめた。F-BARドメインは膜の曲率を認識する構造ドメインであることからも、この構造領域がエンドサイトーシスと膜張力との関係に関与していることは興味深い結果である。
課題Ⅲ：細胞運動時における膜の動的ロジスティクスの定量的時空間解析
カベオラには膜張力に応じて細胞膜の面積を調節する緩衝作用があることが報告されていたが、その仕組みについては解明されていない。ここでは、カベオラを構成する2つの重要なタンパク質caveolin1、cavin1に蛍光タンパク質を融合させて培養細胞に発現させ、張力との関係性を調べる実験系を構築した。通常の細胞では、カベオラは30-50nm程度の小さい開口部を持ち、クラスリン被覆ピットよりも長い持続時間(数分)を持つ。また、カベオラは、caveolinとcavinの発現量に応じて大きく形状を変えることが知られているため、これらの発現量を制御する系の構築に取りかかっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画は概ね順調に進展している。特に、クラスリン依存的エンドサイトーシスの閉口過程に見られる特徴的な膜構造の形成に関与するタンパク質をRNA干渉により同定したことは非常に大きな成果である。従来の様々な蛍光顕微鏡技術ではタンパク質局在の情報しか得られなかったが、我々が独自に確立した「高速AFMと蛍光の相関イメージング法」用いたことで、膜形状の変化に関与するタンパク質を同定することに成功したインパクトは大きい。また、その分子メカニズムにも迫る成果を得ており、クラスリン依存的エンドサイトーシスの分子機構の解明に向けた重要な成果が得られた。課題Ⅲに関しては、カベオラの開口径がクラスリンよりもはるかに小さいため、カベオラのイメージング技術の確立に予定以上の時間がかかった。本年度中にcaveolinの蛍光イメージングと高速AFMとの相関イメージングが確立できたので、今後、張力および細胞運動との関係性を解明する実験を推進する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
膜変形におけるCIP4の機能解明により、これまでの膜構造変化機構に関するモデルに若干の変更を加える必要が生じた。これらの情報に基づき、今後は2Dモデル、3Dモデルの新たな構築に取り組む。これに関しては、引き続き米国カリフォルニア州立大学のRangamani博士との共同研究を推進する。研究項目Ⅲに関しては、膜張力との関係性が示されてきたカベオラに着目し、caveolin, cavinのタンパク質量とカベオラ構造との関係性を明らかにすると共に、細胞運動時の動態に関して解析をすすめる。これに関しては引き続きマドリード大学のM.A. del Pozo教授と共同研究でおこなう。
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