2019 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of function of Hikeshi affecting cellular homeostasis
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18H02442
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
今本 尚子 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20202145)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小瀬 真吾 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90333278)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 核ー細胞質間輸送 / 分子シャペロンHsp70 / HSF1 / タンパク質毒性ストレス / Hikeshi / タンパク質の恒常性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Hikeshiをノックアウトすると、正常時でも、Hsp70の核内集積が阻害される。正常のヒト細胞では、HSF1のターゲット遺伝子は、緩やかに活性上昇する。これが、核内Hsp70の消失によるものであることを証明する知見を以下のように重ねた。
１）SV40T抗原の核局在化シグナル（NLS)を負荷したHsp70を細胞に導入してHsp70を人為的に核に送り込むと、HSF１の活性が抑制されるので、Hikeshiの欠損でHSF1の活性が抑制されるのは核内Hsp70の機能であることを示している。
２）核局在化シグナルもしくは核外移行シグナルを負荷したルシフェラーゼを野生型もしくはHikeshiノックアウト細胞に導入して、ルシファラーゼ活性を指標にルシフェラーゼタンパク質の安定性を解析すると、Hikeshiノックアウト細胞では核のルシフェラーゼが顕著に不安定になることがわかった。細胞質では不安定にならない。このことから、Hikeshiノックアウト細胞ではHsp70の核内輸送を通して、核におけるタンパク質恒常性維持機能が低下することが強く示唆された。
次に、核内Hsp70がHSF1と結合することで、HSF1の活性が抑制される可能性について、proximityアッセイなどを利用して調べた。しかし、明確な結果を得ることができず、この可能性についてはまだはっきりしない。また、タンパク質分解シグナル(CL1-degron)を付加した核局在化タンパク質EGFP-NLS-GST-CL1の安定発現細胞を樹立し、このタンパク質をモデル基質としてユビキチン-プロテアソームシステム(UPS)の活性を解析する系を考案して動かしている。現在、この核局在化モデル基質の分解活性を、野生型細胞とHikeshノックアウト細胞で解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Hsp70の細胞質における機能に関しては多くの解析があり、よく知られている。しかし、Hsp70の核の中の機能についての解析報告は殆どない。これまでの解析で、HSF１の活性化が核内Hsp70の消失によるものであるという確かな知見の蓄積が得られた点については評価できる。核内Hsp70の消失で、核におけるタンパク質恒常性維持機機能が低下する結果が得られていることも大きな前進である。しかし、そのことによって、核の機能にどのようなダメージがあるのかを示す必要がある。核のクロマチン動態を観察するなど、具体的な知見が必要であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、核と細胞質それぞれのタンパク質分解活性やタンパク質凝集活性がHikeshi機能の欠損でどのような影響を受けるかを調べる。また、熱ストレス時では、Hikeshiが欠損するとp53が安定化されるので、そのメカニズムを視野に入れるため、Hikeshiノックアウトで見られる核におけるタンパク質恒常性維持機能の低下が、タンパク質の分解活性にどのように影響するかを調べる。Hikeshi欠損がクロマチン動態に影響を与えるかも調べる。
さらに、Hikeshiの機能（Hsp70の核内機能）を包括的に理解するため、分裂酵母ににおけるハイスループット遺伝子相互作用マッピング（PEM）システム（Roguev他、Cold Spring Harb. Protoc. 2018）を使うことで、Hikeshiとの合成致死因子を同定していく。
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