2018 Fiscal Year Annual Research Report
Quantitative understanding of the mechanism of G1-S phase checkpoint regulated by ERK signal
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18H02444
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
青木 一洋 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 教授 (80511427)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ERK / G1/S / チェックポイント / Akt |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞周期はすべての生命にとって必要不可欠な現象であり、細胞周期の制御機構は精力的に解析が進められてきた。とくに外部の栄養状態などを認識し、細胞周期を進めるかどうかを決定するG1-S期チェックポイントは基礎的にも臨床的にも重要である。この分子機構としては、成長因子によって古典的MAPキナーゼであるERKが活性化し、サイクリンDの発現、RBのリン酸化、E2Fによる遺伝子発現を介してG1-S期のチェックポイントが進行することが報告されている。しかし、連続的（アナログ的）に変動するERK活性がどのようにして離散的（デジタル的）で不可逆なG1-S期チェックポイントを誘導するのか、とくにその閾値の決定機構については全く明らかになっていない。本研究では、生細胞イメージングによるERK活性と細胞周期関連因子を可視化、定量化し、G1-S期チェックポイントのアナログ-デジタル変換による閾値決定機構を明らかにすることを目的とする。
本年度は、1. ERKとAktのレポーターと細胞周期レポーターの同時タイムラプスイメージング、2. RBのFRETバイオセンサーの構築、を行った。1に関しては、MCF-10A細胞にERK、Aktのレポーターと細胞周期のレポーターを導入し、数日間にわたるタイムラプスイメージングに成功した。その結果、AktはERKと同様に確率的に活性化する発火現象を示すこと、またERKとAktの活性に強い相関があることが分かった。ERKの上流のMEKを阻害するとG1期でストップするが、Aktの上流のPI3K阻害剤やAkt阻害剤で処理すると、G1期だけでなくS/G2期でストップする細胞集団が現れることも分かった。2に関しては、RBにCFPとYFPを付与し、細胞周期における変化を観察したところ、M期の終期にFRET効率が急激に減少することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ERKの長時間イメージングの実験系は立ち上がった。また光遺伝学によってERK、Akt、または両方を活性化できる系も構築済みであり、実験結果から得られた作業仮設をすぐに検証できる準備は整っている。またRBのFRETバイオセンサーはこれまでに全く報告されておらず、非常に価値がある研究結果が得られつつある。これらの理由により、本研究課題はおおむね順調に進展していると結論づけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ERKとAkt、細胞周期状態の長時間タイムラプスイメージングの結果を統計解析し、ERKやAkt活性のどのような動態が細胞周期の進行に寄与するのかを定量的に示す。さらに、光遺伝学的な手法により、ERKやAktを様々な細胞周期で活性化した際に、細胞周期の進行が期待通り進むのかどうかを検証する。RBのFRETバイオセンサーについては、CDKによってリン酸化されるサイトをすべてアラニンに置換した変異体を用いることで、FRET効率の変化にCDKによるリン酸化が関与しているのかどうかを検証する。
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