2019 Fiscal Year Annual Research Report
Study on the physiological roles of naturally occurring auxins in plants with distinct transport characteristics
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18H02457
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
笠原 博幸 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00342767)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | オーキシン / フェニル酢酸 / 生合成 / 代謝 / フェニルアラニン / インドール-3-酢酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オーキシンのインドール-3-酢酸（IAA）は植物の細胞伸長や細胞分化を調節する非常に重要な植物ホルモンである。最近、フェニル酢酸（PAA）が重力方向に極性移動しないユニークな特性をもつことが明らかになった。しかし、植物におけるPAAの生合成や生理的役割はまだ解明されていない。
フェニルアラニン（Phe）合成酵素であるアロゲン酸デヒドラターゼ（ADT）のPAA生合成における役割について調べた。シロイヌナズナの６つのADT遺伝子の各過剰発現体に含まれるPAAとその主要代謝物であるPAA-アミノ酸結合体の量を測定した。その結果、ADT4/ADT5過剰発現体でPhe、PAA、PAA-アミノ酸結合体の量が顕著に増加していた。一方、adt13456多重欠損変異体ではこれらの内生量が減少していた。また、PAA生合成の予想中間体であるフェニルピルビン酸（PPY）を分析したところ、ADT4/ADT5過剰発現体で増加し、adt13456変異体で減少することが判明した。これらの結果、ADTはPAA量を調節する重要な酵素であり、またPPYがPAA生合成中間体である可能性が高いことなどが示された。
シロイヌナズナのIAA不活化酵素であるIAA-カルボキシルメチルトランスフェラーゼ 1（IAMT1）がPAAの濃度調節において果たす役割について調べた。大腸菌で調製したIAMT1タンパク質を用いて酵素活性試験を行ったところ、本酵素がIAAとPAAに対して同程度の代謝活性を示すことが判明した。しかし、顕著なオーキシン欠損の表現型を示すIAMT1過剰発現体では、IAAのみ減少していた。一方、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術で作成したiamt1欠損変異体は明確な表現型を示さず、またIAAとPAA量に変化は見られなかった。これらの結果などから、IAMT1はIAAを特異的に代謝していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、フェニルアラニン合成酵素のADTが植物のPAA量を調節する重要な酵素であることを明らかにした。また、フェニルピルビン酸（PPY）の分析法を新たに確立し、ADT過剰発現体やadt欠損変異体のPPY分析によって、これがPhe下流のPAA生合成中間体である可能性が高いことを示した。
さらに、シロイヌナズナのIAA不活化酵素であるIAMT1が、in vitroではIAAとPAAの両方をメチル化するにもかかわらず、in vivoではIAAを特異的に代謝していることを明らかにした。また、シロイヌナズナに存在する24種のIAMT1ホモログのうち、相同性が比較的高い8種のホモログについて大腸菌で組換えタンパク質を調製して酵素活性試験を行った。結果的に、いずれもIAAとPAAに対して酵素活性を示さなかった。研究計画当初に期待したPAA特異的なメチル化酵素の同定には至らなかったが、当初の予定よりも多くのIAMT1ホモログを詳細に解析することができた。
本研究課題でオーキシン代謝物の分析技術を改良したことにより、他のオーキシン研究の論文発表にも貢献することができた。
これらの進捗状況から、本研究課題は概ね順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、シロイヌナズナのTAR3とTAR4遺伝子について、それぞれの遺伝子過剰発現体や欠損変異体のフェニルピルビン酸やオーキシン代謝物の分析から、PAA生合成に寄与する可能性を検証する。さらに、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術により、tar3 tar4二重欠損変異体を作成し、これら2つの遺伝子のPAA生合成への寄与を調べる。また、PAAは高等植物だけでなくコケ植物にも分布することから、モデル植物であるゼニゴケ（Marchantia polymorpha）のTAR3/TAR4ホモログ遺伝子の欠損変異体を作成し、この遺伝子ホモログがPAA生合成に寄与する可能性について検証する。
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