2018 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on novel abscisic acid signaling mechanism
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18H02458
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
轟 泰司 静岡大学, 農学部, 教授 (30324338)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡本 昌憲 宇都宮大学, バイオサイエンス教育研究センター, 助教 (50455333)
大西 利幸 静岡大学, 農学部, 准教授 (60542165)
竹内 純 静岡大学, 農学部, 助教 (00776320)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アブシシン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アブシシン酸（ABA）の非PYL経路に関わる未知受容体の探索を目的として以下の研究を実施した。
(1)生化学的手法による探索（担当：轟，竹内）
クリック反応によりビオチンタグを導入するため，PANMeのメチル基の代わりにエチニル基を導入した化合物PANC≡CHを新規PANsとして合成した。イネ実生伸長試験において，この化合物はPANMeよりも強いABA様活性（第二葉鞘伸長阻害）を示したため，これをアルキンプローブとして標的タンパク質のラベル化が可能であるか否か検討した。モデル実験として，PYLタンパク質にPANC≡CHを加え，クリック反応により末端にアミノ基を有するビオチンタグを導入した後，アミノ基同士の架橋剤であるBS3を用いてビオチンタグとPYLタンパク質とを共有結合させた。ウェスタンブロッティングによりPYLのラベル化を確認したところ，アルキンプローブ非存在下においてもPYLのバンドが検出された。次年度は，この非特異的なタンパク質結合を減少させるようなラベル化条件を検討する。
(2)化学遺伝学的手法による探索（担当：岡本，大西，竹内）
標的遺伝子を迅速に同定するため，ゲノムワイド関連解析（GWAS）が適応出来るか否か検討した。GWASとは，設定された集団に存在する個体間の形質の違いとDNA配列との関連をゲノム全体にわたり調べることにより，対象とする形質と関連するDNA多型を統計的に検出する方法である。日本在来イネ・コアコレクション50品種を用いてPANSF5（PANMeより強いABA活性を示すことが分かっている構造類縁体）による第二葉鞘伸長阻害を形質として調査したところ，品種間で明確な差を確認することが出来た。従って次年度は，PANSF5による阻害率を形質の値として，それに関連するDNA多型をGWASにより検出することでPYLとは異なる未知ABA受容体の候補遺伝子を選抜する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は，アブシシン酸（ABA）シグナル伝達の現在の研究の中心になっているPYL経路ではなく，それとは異なるABAシグナル伝達経路の存在に着目し，それを，研究代表者らが独自に開発したPYLアンタゴニストPANsを用いて，(1)生化学的手法ならびに(2)化学遺伝学的手法の両面から探索することを目的としている。(1)については，目的の生物活性を有するプローブ合成に成功し，現在は非特異的ラベル化を低減する条件検討を行っているため，このまま当初計画に沿って研究を推進していく予定である。また(2)についても，当初の計画通り，日本在来イネ・コアコレクション50品種を用いた形質調査を実施して，GWASの適用が可能な結果が得られており，このまま当初計画に沿ってGWASによるDNA多型の検出を実施する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画に沿って，(1)生化学的手法ならびに(2)化学遺伝学的手法の両面から，アブシシン酸（ABA）シグナル伝達に関わる非PYL経路関連因子の探索を実施する。
(1)生化学的手法による探索：PYLタンパク質を用いたin vitroモデル試験系によるアルキンプローブとアミノ基反応性ビオチンタグの活性評価
大腸菌発現系により調製したPYLにPANC≡CHまたは11'-acetylene tetralone ABAを加え，クリック反応により末端にアミノ基を有するビオチンタグを導入する。その後，アミノ基同士を架橋させるBS3を添加することでビオチンタグとPYLタンパク質とを共有結合させ，ウェスタンブロッティングによりPYLのラベル化を確認する。これにより標的タンパク質のラベル化条件を確立する。
(2) 化学遺伝学的手法による探索：ゲノムワイド関連解析（GWAS）による非PYL経路関連遺伝子の探索
日本在来イネ・コアコレクション50品種を用いてPANSF5に対する感受性の違いを調べたところ，節間伸長阻害において品種間で明確な差が見られたため，今後はこのデータを基にGWASを行い，PYLとは異なる未知ABA受容体およびその下流因子の候補遺伝子の絞り込みを行う。
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Research Products
(1 results)
