Studies on novel abscisic acid signaling mechanism

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02458
• Research Institution: Shizuoka University
• Principal Investigator: 轟 泰司 静岡大学, 農学部, 教授 (30324338)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 昌憲 宇都宮大学, バイオサイエンス教育研究センター, 准教授 (50455333) ; 竹内 純 静岡大学, 農学部, 准教授 (00776320) ; 大西 利幸 静岡大学, 農学部, 准教授 (60542165)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アブシシン酸

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに，イネで機能する新規ABA受容体を見出すことを目的として，イネ・コアコレクション109品種に対するPANSF5（ABA受容体PYLのアンタゴニストであるPANsの中で最も強いABA活性を示す化合物）のイネ第二葉鞘伸長阻害率を「形質の値」としてゲノムワイド関連解析を行い，第3染色体にPANs感受性と関連がありそうなDNA多型を複数見出した。その中で，アミノ酸配列に変異をもたらすDNA多型が存在する遺伝子としてOs03g0661800に着目し，これら遺伝子がコードするタンパク質を未知ABA受容体の候補タンパク質として選抜した。また，簡便且つ汎用的な方法でPANs結合活性を評価する系として，標識プローブを用いたラベル化法を確立した。そこで本年度は，PANSF5標的候補遺伝子Os03g0661800の異種発現系の構築を試みた。シロイヌナズナにおいて相同性検索を行ったところ，AtPARK13に最も高い相同性（45%）を示した。AtPARK13はミトコンドリアに局在するプロテアーゼであり，熱ストレス応答に関与することが報告されているPDZドメインタンパクである。AtPARK13の発現条件を参考に，大腸菌発現系を採用してベクターおよび菌株を数種検討したが，タンパク質の発現には至らなかった。また，農研機構との共同研究を開始し，Os03g0661800の遺伝子破壊株を作成するための準備を進めた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度までは当初の計画通り，化学遺伝学的手法と生化学的手法を組み合わせることで，イネで機能する新規ABA受容体の探索を進め，標的遺伝子を選抜するとともに，PANs結合活性を評価できるタンパク質ラベル化法を確立した。本年度は標的タンパク質の異種発現系を確立する予定であったが，大腸菌発現系を採用してベクターおよび菌株を数種検討したが，タンパク質の発現には至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

ゲノムワイド関連解析（GWAS）により選抜したPANs標的候補タンパク質の異種発現系の構築とCRISPR-Cas9システムによる標的候補遺伝子Os03g0661800の欠損株作成を予定している。
本年度，GWASにより選抜したOs03g0661800遺伝子がコードするPDZドメインタンパク質の大腸菌発現を試みたが，ベクターの種類や大腸菌株を種々変更してもタンパク質を発現させることができなかった。そこで，宿主を酵母または昆虫細胞に変更してPDZドメインタンパク質の発現検討を行う。タンパク質が発現できたら，すでに構築したラベル化法によりPANsとの結合活性を評価する。またOs03g0661800遺伝子には，二つのSNPからなるハプロタイプが3種類（Hap. A, Hap. BおよびHap. C）存在するが，Hap. C型ではHap. A/Hap. Bと比較してPANSF5感受性が低い。そこで，Hap.AであるOs03g0661800の575番目のLysを部位特異的変異導入によりArgに置換したHap.C型を作成し，ハプロタイプ間でPANs結合活性に違いがみられるかどうかを検証する。また，農研機構からCRISPR-Cas9ベクターを提供していただき，変異株作成を試みる。