バクテリアコンデンシンの一本鎖DNAローデイング機構の遺伝生化学的研究

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02485
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 仁木 宏典 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 教授 (70208122)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 核様体 / コンデンシン / DNA結合 / 一本鎖DNA / CT変換

Outline of Annual Research Achievements

一本鎖DNAのin vitro ローディング実験 バクテリアの細胞内では、(i)転写領域、(ii)複製領域、(iii)ループ&ステム二次構造のステム部分(Cruciform)で一本鎖DNA領域が形成され 、このいずれかにバクテリアコンデンシンがロードされると予想される。これまでの研究から、バクテリアで最も転写活性の強いといわれるrRNAオペロンの領域にバ クテリアコンデンシンSmc-ScpABが細胞内で選択的に結合していることが強く示唆された。そこで、rrn遺伝子を持ったプラスミドを使い、バクテリアコンデンシンの転写領域へのトポロジカル結合を調べた。
(1)in vitro 転写系と共役したコンデンシンのローディング
バクテリアのin vitro転写系と しては大腸菌RNAポリメラーゼ系、T7RNAポリメラーゼ系の2つをそれぞれ使用した。この転写系に精製MukBタンパク質を添加し、プラスミドへのローディングをトポロジカルローディングアッセイにより検出を試みた。しかし、この実験から転写と共役したMukBのローディングを確認することができなかった。
(2)Rループへのコンデンシンのローディング 枯草菌のSmc-ScpABのrrn遺伝子への効率的な結合には、rrn遺伝子は転写時に、オペロンの内部に一本鎖DNA構造(Rループ構造)が形成されることが重要である。細胞内のrrn遺伝子領域内にRループ構造が形成されているか、その形成箇所の検出を行った。検出方法としてはin situ Sodium Bisulfate法を用いた。この方法ではまず一本鎖DNA上のシトシン(C)をウラシルへと化学修飾し、最終的にチミン(T)に変換する。次世代シーケンスによりシトシンからチミンの変換しているリードの割合を算出し、そのCT変換効率により、細胞内での一本鎖DNAの開裂の傾向の測定を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

(1)in vitro 転写系と共役したコンデンシンのローディングでは、大腸菌RNAポリメラーゼ系とT7RNAポリメラーゼ系の転写系の塩濃度を、転写活性を維持したまま精製MukBタンパク質またはSmcタンパク質のプラスミドへのローディングに最適な条件に調製する点で、さらに改善する必要がある。この条件の設定が進んでいない。
(2)Sodium Bisulfateにより、一本鎖DNA上のシトシンをウラシルへと化学修飾し最終的にチミンに変換し、シトシンからチミンの変換効率により、細胞内での一本鎖DNAの開裂の傾向を観察することができることができた。さらに定量的な結果を出すために、再現性などを含め、条件を検討する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

Sodium Bisulfateにより、一本鎖DNA上のシトシン(C)をウラシルへと化学修飾し最終的にチミン（T)に変換し、シトシンからチミンの変換効率を統計的に解析して、領域ごとの一本鎖DNAの開裂をよく反映した結果を示すように、データの処理方法を検討する。また、これまでに作成したrrn遺伝子の欠失変異体のSodium BisulfateによるCT変換効率を算出する。