2019 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類鋤鼻器進化におけるDlx4遺伝子コオプション進化の解析
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18H02490
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00370114)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 発現制御 / 進化 / 発生 / エンハンサー / ゲノム編集 / Dlx遺伝子 / 鋤鼻器 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度は以下の実験研究を行った。
前年度までに、鋤鼻器でのDlx各遺伝子の発現量解析を行い、さらにDlx3/4遺伝子の鋤鼻器エンハンサーを同定した。同定したエンハンサーのノックアウトマウスの作製も完了した。令和元年度の実験ではこのマウスを用いて、エンハンサーがDlx3/4遺伝子発現に及ぼす影響を定量的に測定した。具体的には、Dlx3野生型配列に同義置換を導入したゲノム編集マウス系統を作成し、これを各種変異マウス（エンハンサーノックアウトマウスなど）と交配することでヘテロ接合マウスを作成した。これにより、父方由来と母方由来のアリールを区別することが可能になり、完全に同一のトランス因子核内環境下でのcis因子の違いによるアリール間でのDlx3発現量の違いを正確に定量解析できるようになった。この同義置換導入単独ではDlx3/4発現が影響を受けないこと、雌雄での差がないこと、インプリンティングの影響が見られないことも確認できた。この同義置換導入マウスと各種変異導入マウスの掛け合わせF1個体のRNA-seq解析を行い定量的な発現を調べたところ、鋤鼻器と鰓弓に発現活性を示すTAD3エンハンサーの欠失アリールでは、野生型アリールに対して鰓弓において６０％ほどに発現活性が低下することが示された。現在鋤鼻器での発現解析が進行中である。逆に、鰓弓のみに発現活性を示すDlx5/6領域から分離されたエンハンサー（meDlx#19）をTAD3エンハンサー近傍にノックインしたアリールでは、鰓弓においては野生型アリールに対して１５０%程度の発現活性上昇を示したが、鋤鼻器においては野生型との差は見られなかった。また、Dlx4のノックアウトアリールではDlx3の発現が野生型アリールに比較して上昇していることもわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子あるいはエンハンサーの欠失が標的遺伝子の発現にどの程度の影響を与えるかを定量的に測定する方法の開発は非常に重要である。令和元年度に私達はエンハンサーがDlx3/4遺伝子発現に及ぼす影響を定量的に測定する新しい実験系を開発した。具体的には、Dlx3野生型配列に同義置換を導入したゲノム編集マウス系統を作成し、これを各種変異マウス（エンハンサーノックアウトマウスなど）と交配することでヘテロ接合マウスを作成し、父方由来と母方由来のアリールの区別を可能とし、完全に同一のトランス因子核内環境下でのcis因子の違いによるアリール間でのDlx3/4遺伝子発現量比率をRNA-seqで正確に定量解析できるようになった。従来の方法として、異なる遺伝的背景のマウスの掛け合わせヘテロ（C57BL/6NとMSMなど）を利用してアリールを区別する手法があったが、ゲノム全体に渡って多量の変異があるため、エンハンサーのシス活性の微妙な変化を解析するには不適当であったが、今回の方法で純粋な変異体アリール間の発現活性変化を明らかにすることが初めて可能になった。私達のこの方法をAccu-Cis法（Accurate evaluation of cis-regulatory function）と名付けた。またこの手法を応用することで、多種の変異アリールを迅速に定量発現解析できるようになり、エンハンサーの欠失挿入が及ぼす影響を定量的に考察することができるようになったため、これを参考に液液相変化の概念を取り入れた新しい遠位エンハンサーの作用モデルを提唱し発表した（Sumiyama and Tanave, DGD 2020）。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はこの変異アリール発現量定量評価実験系をさらに活用し、多くの変異体をゲノム編集で迅速作成し、発現量解析を行いその影響を体系的にまとめていく予定である。COVID-19の影響により３ヶ月以上の実験中断を余儀なくされたため、これまでに鋤鼻器のデータがまだ十分に取れていないので、今後は鋤鼻器のデータをさらに増やし、Dlx3/4遺伝子クラスターでのエンハンサーの進化と鋤鼻器におけるその影響を明らかにしていく計画である。定量的な発現変化データをもとに、あらためて変異体の行動実験を行い、行動の変化に及ぼす影響を解析する。また、これから作成する鋤鼻器エンハンサー欠失体が鋤鼻器でのDlx遺伝子のコンディショナルノックアウト・ノックダウンとなっている場合には、鋤鼻器形成とその機能に与える影響の評価を行う予定である。以上のデータをまとめて論文として発表する。
なお、COVID-19の影響により令和二年度の実験に大幅な遅れが出ることが予想されるため、必要に応じて繰越等の対応も検討する。
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Research Products
(10 results)
