2020 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質の小型標識法開発とへテロオリゴマー解析
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18H02561
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松崎 勝巳 京都大学, 薬学研究科, 教授 (00201773)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 義明 京都大学, 薬学研究科, 講師 (60402799)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 蛍光イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Gタンパク質共役型受容体 (GPCR) 等の膜タンパク質のヘテロ会合を検出するため、当研究室で開発したE3-K4コイルドコイル標識法とorthogonalな新規タグープローブペアの開発を引き続き行った。
タグープローブ認識部位に2つのアスパラギン残基を導入したEN24タグーKN24プローブペアをデザインした。β2AR のN末端にEN24タグ、C末端にタグ付加膜タンパク質の発現確認用にEYFPを付加したプラスミドDNA（r-sp-EN24-β2AR-EYFP）を作成した（r-spは、GPCRの膜表面への輸送を促進することが報告されているシグナルペプチド）。また、Alexa Fluor 568標識KN24プローブを合成した。
CHO-K1細胞にr-sp-EN24-β2AR-EYFPを一過性発現させ、KN24プローブを種々の濃度で添加し、細胞膜上でのAlexa Fluor 568蛍光強度を測定することにより、EN24タグーKN24プローブ間の解離定数は、20.4 ± 3.3 nMであった。この値は、前年度報告したアスパラギンを1つしか含まないEN3.5-KN3.5ペアの解離定数48.7 ± 16.7 nMより、2.5倍小さく、タグープローブ間の結合性が向上した。
また、EN24タグーKN24プローブペアはE3タグ-K4プローブペアと交叉性がないことが確認された。
従って、100 nMのKN24プローブを添加することによりEN24タグ付加膜タンパク質全体の83%を標識することが可能であり、E3タグーK4プローブペアと併用することによって、生細胞膜上における膜タンパク質のヘテロな会合状態を検出できる可能性が示唆された。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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