2018 Fiscal Year Annual Research Report
A novel calcium store and Ca2+ release in secretory cells
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18H02564
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
平嶋 尚英 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (10192296)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | カルシウムストア / 分泌細胞 / Orai / マスト細胞 / エクソサイトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）CRISPR-Cas9によるOrai-2ノックアウト-マスト細胞による解析：Orai-2が細胞内Caイオン動態およびエクソサイトーシスによる分泌にどの程度寄与しているかをより正確に評価するために、CRISPR-Cas9によってOrai-2をノックアウトしたマスト細胞株（RBL-2H3細胞）の構築を試みた。構築したノックアウトのためのプラスミドを、RBL-2H3細胞に導入し、共発現するGFPの蛍光を指標に、クロ－ニングを行ったが、Orai-2のノックアウト株は得られなかった。現在、さらに３種類の配列を組み込んだノックアウトのためのプラスミドを構築し、現在、クローニングを行っている。
（２）Orai-2の活性化機構の解明：ERにはOraiを活性化するCa2+センサー蛋白質であるSTIMが２つ（STIM-1とSTIM-2）が存在する。そこで、蛍光蛋白質CFPとYFPをORAI-2とSTIM-1（または-2）と結合させた蛋白質の発現系を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングによってORAI-2とSTIMの相互作用を単一細胞で明らかにするために、発現プラスミドの構築とRBL-2H3細胞への導入まで確認した。
（３）分泌顆粒内のCa2+濃度動態：分泌顆粒が細胞内Caストアとして機能するかどうかを検証するために、分泌顆粒内と細胞質のCa2+濃度動態を測定する。蛍光蛋白質ベースのCaセンサー（GCaMP、RCaMP）に、分泌顆粒に局在させるためのシグナル配列であるHuman Growth Hormone（hGH）のsignal Sequence（ss）部分を結合させたキメラ遺伝子（hGH-ss-G(R)CaMP）を作製し、RBL-2H3細胞に発現させることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遅れている理由は、主に下記の２点である。
（１）CRISPR-Cas9によるOrai-2ノックアウト細胞の構築が遅れているため。
Orai-2のノックアウトプラスミドを導入した細胞におけるOrai-2の発現を、ウエスタンブロットにより確認したところ、Orai-2の発現がみられた。ノックアウトのために選択したOrai-2の配列が有効でなかったものと思われる。
（２）分泌顆粒内に導入したCaセンサーが機能しないため。
分泌顆粒内のCa2+濃度動態を測定するために、蛍光蛋白質ベースのCaセンサー（GCaMP、RCaMP）に、分泌顆粒に局在させるためのシグナル配列であるHuman Growth Hormone（hGH）のsignal Sequence（ss）部分を結合させたキメラ遺伝子（hGH-ss-G(R)CaMP）を作製し、RBL-2H3細胞の分泌顆粒に特異的に発現させるところまでは成功した。しかしながら、刺激後における分泌顆粒内のCa2+濃度に変化を検出できなかった。理由としては、分泌顆粒内のpHが低く、蛍光タンパク質の蛍光強度が減弱していることが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）CRISPR-Cas9によるOrai-2ノックアウト細胞の構築
ノックアウトのために選択したOrai-2の配列が有効でなかったものと思われるので、さらに追加で複数の配列に基づく、ノックアウトプラスミドを構築し、細胞に導入する。
（２）分泌顆粒内のCa2+濃度動態測定のためのCaセンサー発現細胞の構築
2018年度に用いた蛍光タンパク質ベースのCaセンサー（GCaMP、RCaMP）は、分泌顆粒に局在発現させることはできたが、Ca2+濃度をモニターすることができなかった。
そこで、pH感受性の低い、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光タンパク質ベースのCaセンサー(D1)に、分泌顆粒に局在させるためのシグナル配列であるHuman Growth Hormone（hGH）のsignal Sequence（ss）部分を結合させたキメラ遺伝子（hGH-ss-D1を構築し、RBL-2H3細胞の分泌顆粒に特異的に発現させる。そして、分泌顆粒内と細胞質内のCa濃度変化、および分泌顆粒内とERのCa濃度変化の同時測定を行い、分泌顆粒が新規のカルシウムイオンストアとして機能することを検証する。
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