2019 Fiscal Year Annual Research Report
海洋無脊椎動物由来天然医薬品資源の生合成遺伝子解析と利用
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18H02581
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
脇本 敏幸 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (70363900)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 共生微生物 / 生合成 / spongistatin / フラン脂肪酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Spongistatinは、アリゾナ州立大学 G. R. Pettitらがモルジブ近海の海綿Spongia sp.より見出した細胞毒性物質である。約400 kgもの海綿から10 mgの化合物の精製に成功し、1993年にその構造を報告している。興味深いことに全く同じ化合物が同年、別の海綿から報告されており、3つの異なる名前が同じ化合物に対して付けられている。またそれぞれの海綿は系統的に異なる海綿であり、その生産者は異なる海綿動物に共生する共通の微生物である可能性を示唆している。しかしいずれの海綿においても含有量が低く、稀少な化合物であり、生産菌は共生微生物叢の主要種ではない可能性が高い。Spongistatinの細胞毒性活性は極めて強力であり、各種がん細胞に対して数十pMのIC50値を示す。微小管重合阻害作用が作用機序として明らかになり、抗がん剤として有望視されているが、複雑な構造を有するため、化学合成による供給は容易ではない。本研究では生産菌を同定することで、spongistatinの量産化へ向けた基礎的知見を得る。令和元年度は海綿メタゲノムライブラリーを作製しtrans-AT KSの配列断片を用いたスクリーニングを実施した。
フラン脂肪酸はサケ科魚類や二枚貝より見出された微量天然脂肪酸である。フラン環のすべての炭素上にアルキル基を有した４置換フラン環を含む特異な脂肪酸である。電子豊富なフラン環を有するため、強力な抗酸化活性を示すことが知られている。また我々はフラン脂肪酸エチルエステルがラット関節炎モデルにおいて強力な抗炎症活性を示すことを明らかにしている。本研究では４置換フラン脂肪酸の生合成遺伝子を明らかにし、自然界での分布や生産者の特定を試みるとともに、希少生理活性脂肪酸の異種生産へ向けた基礎的知見の取得を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Spongistatinの構造にはβ-branch構造やピラン環が含まれることから、trans-AT PKSによって生合成されることが予想できる。前年度に、trans-AT PKS のKSドメインに特異的なプライマーを用いてPCRスクリーニングを行った結果、β-branchの生合成に関わるKSドメイン特異的プライマーを用いた場合にのみ遺伝子断片の増幅が見られた。そのため、ライブラリーのスクリーニングにはβ-branchをターゲットとしたプライマーを用いることにした。海綿Hyrtios altumよりメタゲノムDNAを調製し、フォスミドライブラリーを構築した。先に得られたPCR産物の配列に特異的なプライマーを調製し、PCRスクリニーングを実施した結果、複数のポジティブクローンが得られた。現在、それらのシークエンス解析を試みている。
紅色光合成細菌の一種であるRhodobacter sphaeroidesは一重項酸素への防御センサーとしてアンチσ因子ChrRを有する。酸化ストレスを感受したChrRはσ因子と乖離し、下流遺伝子群の転写が促進される。2015年にChrRによって転写制御される遺伝子産物の一つが３置換フラン環を有するフラン脂肪酸であることが報告された。一方で、３置換フラン脂肪酸よりも強力な抗酸化活性を示す４置換フラン脂肪酸の生産菌は未だに報告例がない。そこで、R. sphaeroidesで見出された生合成酵素のホモログをデータベースで検索した結果、複数の菌株においてR. sphaeroidesと同様の推定生合成遺伝子クラスターが見出された。それら菌株の培養菌体から脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルを調製し、GCMSによる分析を行い、脂肪酸組成の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって海綿H. altumメタゲノムライブラリーのPCRスクリーニングの結果、ポジティブクローンが複数得られた。しかしながら、これまでのシークエンス解析の結果、未だspongistatin生合成遺伝子を含んだクローンは得られていないため、引き続きクローンの選抜を続ける。さらに今年度は、海綿H. altumの細胞分画によって共生微生物画分を得て、ゲノムを抽出し、ショットガンシークエンスを並行して試みる。
フラン脂肪酸においては紅色光合成細菌由来の生合成遺伝子情報をもとにホモログを有する複数の菌株代謝物を解析している。未だフラン脂肪酸の検出には至っていないが、培養条件の精査を行い、フラン脂肪酸の検出を引き続き進める。フラン脂肪酸生産菌を同定できれば、生合成経路の詳細な解明を目指す。特にフラン環へメチル基を挿入するタイミングやその酵素反応機構を検証する。また、高生産能を有する菌株を選抜することで、微生物によるフラン脂肪酸生産への道を拓くことができる。
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