2018 Fiscal Year Annual Research Report
Structure-selective metabolome analysis of ABC xenobiotic transporters
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18H02584
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
加藤 将夫 金沢大学, 薬学系, 教授 (30251440)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 膜輸送体 / メタボロミクス / 薬物動態 / 薬物相互作用 / 医薬品開発 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アミノ基を有する親水性化合物を選択的に検出するメタボロミクス技術を確立し、膜輸送体の生体内基質の解明に応用した。膜輸送体発現細胞と対照細胞を可溶化後、誘導体化試薬と反応させたのち、LC-MS/MSを用い、誘導体構造部分由来のfragmentをproduct ionとしたprecursor ion scanningを行うことで、誘導体化された化合物を選択的に検出した。その後、LC-TOF-MSを用いた精密質量分析とMSMSスキャンを行い、データベースと比較することで候補化合物を推定した。以上の系を用い、SLC22A4の内因性基質解明に成功したことから、実験系が確立されたと判断し、ABC膜輸送体P-glycoprotein (P-gp)の内因性基質探索にも応用した。野生型(WT)および遺伝子欠損マウス(P-gp KO)の血漿、脳、肝臓、腎臓ホモジネートに対し、誘導体化を用いたメタボロミクスと誘導体化を行わない手法も検討し、幅広く内因性基質探索を目指した。WTとP-gp KOの間で有意差を示すピークを探索したところ、検出された約20万個のイオンのうち、179個がWTとP-gp KO間でシグナル強度に有意差があった。P-gp KOでWTよりも強いシグナル強度が検出されたイオンは脳に最も多く検出され、血液脳関門での排出輸送体としての役割が裏付けられた。化合物が推定できたイオンの多くがアシルカルニチンであった。本年度はこのほかに、ABC膜輸送体breast cancer resistance protein (BCRP)の基質の体内動態を定量的に解析するための生理学的薬物速度論モデルを構築した。さらに、内因性基質に対する対照として使用可能なBCRPおよびP-gp共通の生体外基質として、抗がん薬regorafenibと活性代謝物についてこれら膜輸送体の体内動態に及ぼす関与を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アミノ基選択的誘導体化も含めたアンターゲットメタボロミクスの系が、今年度に、ほぼ確立した。したがって、次年度以降、種々のサンプルについて未知化合物の探索や同定が可能となり、膜輸送体の生体内基質探索がスムーズに行える状況である。また、遺伝子欠損マウスを用いた系、さらにP-gpやBCRPの特異的阻害剤を投与しこれら膜輸送体を阻害する系も確立できた。したがって、野生型と遺伝子欠損マウスとの比較だけでなく、阻害剤ありとなしの系での比較や、両者を組み合わせた系の比較など、幅広い解析が可能となった。さらに、P-gpとBCRPの基質薬物（外因性基質）を用いた解析も可能となったことから、外因性基質と同様の推移を示す内因性化合物を推定する手法も実施可能となり、これによって、さらに効率的に内因性基質の解明を行うことができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)引き続き、遺伝子欠損マウスを用いた生体内基質のスクリーニングを継続する。欠損マウスより血漿、肝、腎、尿を採取し、野生型と比べ高いシグナルを示す化合物をLC-TOFMSおよび新たに本学に導入され本格的利用が可能となったLC-Orbitrapを使って見いだす。有意差のついた化合物について子マスを検出し、データベースとの照合から化合物を推定する。(2)今年度確立した阻害剤投与によるスクリーニングを並行して実施する。野生型マウスにP-gpとBCRPの両方の阻害剤を投与後、血漿、肝、腎、尿を採取し、(1)と同様の解析を行う。(3)全身レベルでの生体内基質探索だけでなく、皮膚と脳に存在する生体内基質を探索する。(1)と(2)の試験の際に、皮膚と脳を採取し同様な検討を行う。これまでの全身レベルの解析で見出されていないピークを中心に解析を進める。(4)遺伝子欠損マウス臓器可溶化液を基質源として、遺伝子発現細胞を用いたスクリーニングを進める。遺伝子欠損マウス肝、腎、脳、皮膚の可溶化液を遺伝子発現細胞のbasalないしapical側に添加し、basalからapical方向への輸送が逆方向よりも有意に高いピークを選別し、(1)と同様な方法で化合物を推定する。(5)生合成臓器と消失臓器に基づく生体内基質のセレクションについても検討を開始する。 (1)～(4)で検出された化合物の中から、肝の膜輸送体の活性を定量的に反映するものを選別するため、肝を含む多くの臓器homogenateをマウスより調製後、インキュベーションし、選別した生体内基質の生合成速度を測定する。肝での合成が最も高い化合物を選び、同様な臓器homogenateに添加後の消失推移から、肝の消失効率の高い化合物を選ぶ。選ばれたものをマウスに静脈内投与し、腎外クリアランスが全身クリアランスに近い化合物を選ぶ。
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Research Products
(8 results)
