2018 Fiscal Year Annual Research Report
Exosomal regulation of leukocyte trafficking
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18H02622
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
島岡 要 三重大学, 医学系研究科, 教授 (40281133)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
朴 恩正 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (20644587)
高娃 阿栄 三重大学, 医学系研究科, 助教 (50643805)
川本 英嗣 三重大学, 医学部附属病院, 助教 (20577415)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エキソソーム / 細胞外小胞 / 細胞接着分子 / インテグリン / 免疫 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
獲得免疫のシステムの中で中心的な役割を果たすリンパ球であるが、そのクローン数は想定されるマクロオーガニズムのエピトープ数よりも圧倒的に数が少ない。数少ないリンパ球で獲得免疫を効率的に実行するためには、予想されるマクロオーガニズム感染の頻度の高い部位に、選択的にメモリー・エフェクターリンパ球を配置する必要がある。その目的を達成するために、リンパ球が生体内で移動し目的の遠隔臓器に到達するプロセスであるホーミング (Homing) はどのように制御されているのだろうか？ この学術的な問いに答えるべく、本研究では、リンパ球自身が分泌するエキソソームが先回りして遠隔臓器に作用し、ホーミングを制御しているのではないかという仮説を提唱し、検証することを目的とする。
リンパ球ホーミングが過少であればマクロオーガニズム感染を制御するに足るパワーが不足するので、生体防御能が低下する、一方過剰であれば非特異的また周辺へとダメージが拡散するので、自己免疫的な組織障害につながる可能性があるが、ホーミングのバランス制御の詳細は不明である。申請者チームはリンパ球が分泌するインエグリン・アルファ４ベータ７を高レベルに発現するエキソソームが遠隔臓器に作用しホーミングを負に制御する重要なブレーキとして機能する可能性を見出した。本研究では予備研究成果をさらに発展させ、インエグリン・アルファ４ベータ７を高レベルに発現するエキソソームがリンパ球の腸管粘膜特異的ホーミングを負に制御する分子メカニズムを解明し、さらに炎症部位へのリンパ球浸潤抑制効果を炎症性腸炎モデルで検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エキソソームを超遠心を用いて分離する方法を確立し、その性質を免疫学的、分子生物学的、物理化学的手法を用いて解析する方法を確立してきた。またエキソソームに発現する細胞接着分子の活性を、その発現レベルやリガンドとの結合能や、シグナル伝達性に焦点を当てて測定する方法も確立してきた。エキソソーム表面に高発現するインエグリン・アルファ４ベータ７は、HEV内皮細胞表面に発現するMAdCAM-1をターゲティングし、腸管組織に特異的な分布を可能にすることを支持する実験的なデータを蓄積してきた。エキソソーム精製分離については、まずレチノイン酸で処理することにより、リンパ球活性化は腸管での抗原提示を実験的に模倣し、腸管ホーミング能をもつインエグリン・アルファ４ベータ７を高発現するリンパ球を細胞培養システムの中で誘導する実験系を確立した。培養上清に分泌されたエキソソームを超遠心により分離した。分離したエキソソームの品質は粒子径分布（動的光散乱法）とエキソソームマーカーCD9発現（ウエスタンブロット）で確認した。MAdCAM-1結合能を検討する方法としては、エキソソームは直径が小さすぎて直接フローサイロメーター(FACS)での解析は困難であるので、マイクロビーズ表面に固相化してFACSで解析する方法を確立した。エキソソームの生体での臓器分布を明らかにするために、競合的ホーミングアッセイを応用して、エキソソーム体内臓器分布を高感度で評価するアプローチを試みた。蛍光色素でインエグリン・アルファ４ベータ７を高レベルで発現するエキソソームを緑に、無または低レベル発煙エキソソームを赤でラベルし同数を混合後、レシピエントマウスに静注投与した。一定時間後腸管を含む主要臓器を切り出し、緑と赤のシグナル比を蛍光顕微鏡下に比較検討し、色素の影響を除外するため赤と緑の逆の組み合わせも検討し、組織分布を明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の方向性としては、「リンパ球自身が分泌するエキソソームが先回りして遠隔臓器に作用し、ホーミングを制御しているのではないか」という仮説を検証するために以下の検討をおこなう予定である。インエグリン・アルファ４ベータ７を高レベルで発現するエキソソーム取り込み後、HEV内皮細胞のリンパ球ホーミングをサポートする機能（リンパ球接着と経内皮細胞遊走能）が、どのように影響を受けるのかを検討する。具体的には、マウスモデル血管内皮細胞b.End3の遺伝子発現変化を明らかにするために、キソソームと血管内皮細胞を共培養し、エキソソーム取り込みを蛍光顕微鏡で検討し、MAdCAM-1とケモカイン発現レベルをFACSとRT-PCRでを解析する方針である。リンパ球経内皮細胞遊走能に対する効果をボイデンチャンバー法で検討する。エキソソームと共培養した血管内皮細胞をボイデン（Transwell）チャンバーのインサートメッシュ上に単層培養し、T細胞の経内皮細胞遊走を誘導・促進する内皮細胞機能を比較検討する計画である。 リンパ球ホーミング抑制能を検討するために、レシピエントマウスにエキソソームを投与し前処理し、次に蛍光ラベルしたドナーT細胞を静注し、一定時間後に臓器を取り出し、腸管組織や他の臓器へホーミングしたリンパ球数をFACSで定量的に解析する予定である。また一部のマウスでは切り出した臓器切片でHEV血管内皮でのMAdCAM-1とケモカインタンパク発現量を免疫染色で半定量的に評価し、想定されるホーミング抑制効果との関連を評価する経過である。
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Research Products
(1 results)
