2018 Fiscal Year Annual Research Report
腎近位尿細管上皮細胞を足場とするレプトスピラの感染機構の解明
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18H02655
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
Toma Claudia 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40325832)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | レプトスピラ / 腎臓 / 上皮細胞 / 定着 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レプトスピラは、多くの哺乳動物の腎臓に定着し尿中へと排出される。ヒトでも、レプトスピラは長期間腎臓に感染することが知られているが、その機構は理解されていない。尿細管に定着した菌に対しては抗菌薬が無効であり、宿主の免疫システムによっても排除されないため、レプトスピラの持続感染戦略を理解するのは重要である。
申請者は、感染マウスの腎臓を電子顕微鏡にて観察し、感染後期では菌は近位尿細管上皮細胞の微絨毛に付着し、バイオフィルムを形成することを見出した。本研究では、このバイオフィルム形成の初期段階で必要なレプトスピラのリガンドと宿主受容体の同定と、感染によって誘導されるタンパク質の動態を解析し、レプトスピラの腎臓の長期間定着を可能とする分子機構を解明する。
具体的には、動物感染モデルと培養細胞を用いてレプトスピラの感染によって発現が変化する宿主または細菌のタンパク質に焦点を当て、当該分子の役割を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、レプトスピラと尿細管上皮細胞の相互の解析を進めるための実験系の立ち上げとRNAseqの解析を開始した。感染24時間後には、586個の遺伝子が発現を変化することを認めた。さらに、レプトスピラで感染させた上皮細胞を蛍光免疫染色し、共焦点レザー顕微鏡を用いて精査した結果、細胞間のE-cadherinが消失することを見出した。ウエスタンブロティングにて、病原性レプトスピラは尿細管上皮細胞のE-cadherinを切断し、Soluble E-cadherinに相当する約80kDaの分子が細胞外に放出されることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画1. 平成30年度でRNAseq解析にてレプトスピラ感染後に発現が上昇すると同定した多量体免疫グロブリンレセプター(pIgR)について、さらに詳細な解析を進める。抗-pIgR抗体を用いて、実際に感染細胞でレプトスピラと共局在するか否か蛍光免疫染色にて確認する。また、抗体がレプトスピラの尿細管上皮細胞への付着を阻害するか否かを調べる。さらに、pIgRが菌の付着成立に必須であるかを明らかにするために、siRNAまたはCRISPR-Cas9を用いたゲノム編集システムを用いて、pIgRノックアウト細胞を作製し、レプトスピラの細胞への付着の低下が起きるかをqPCRにて評価する。
計画2. 平成30年度は、病原性レプトスピラは尿細管上皮細胞のE-cadherinを切断し、Soluble E-cadherinに相当する約80kDaの分子が細胞外に放出されることを明らかにした。平成31年度では、レプトスピラの分泌型HtrAファミリーセリンプロテアーゼがE-cadherinの切断とレプトスピラの腎臓定着に関与しているかを調べる。
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