2018 Fiscal Year Annual Research Report
Induction of Cancer Stem Cell Properties by GPNMB
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18H02676
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
加藤 光保 筑波大学, 医学医療系, 教授 (20194855)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GPNMB / がん幹細胞 / 休眠期がん細胞 / 抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GPNMBは、増殖が停止した乳がん細胞で特異的に細胞表面に発現し、幹細胞性を誘導することで腫瘍性増殖をもたらす。この独自の研究成果（Okita et al., Sci Signal, 2017; Chen et al., Cancer Res., 2018）に基づき、増殖が停止したがん細胞でGPNMBが特異的に細胞表面に発現し、幹細胞性を誘導するシグナル機構を明らかにすることを本研究期間内の研究目的とした。GPNMBが幹細胞性に関わることを示した研究は他に例がない。GPNMBの幹細胞性誘導に必須の翻訳後修飾部分として、細胞外の糖化秋色部位ならびにリン酸化hemITAMに結合する抗体の作製を進めた。さらに、GPNMBを細胞表面に発現している休眠期の乳がん幹細胞を分取して、GPNMBのリン酸化hemITAMペプチドに結合する分子を免疫沈降させて超高感度質量分析によって同定するための準備を進めた。GPNMBを細胞表面に発現している休眠期がん細胞をFACSや磁気ビーズを用いたMACS法で分取し、幹細胞性を獲得した細胞を素早く大量に分取する基本技術も検討している。これらの結果から得たGPNMBの下流シグナル経路の候補分子のノックダウン実験を行い、休眠期の乳がん細胞における幹細胞性誘導のシグナル経路を解明する計画である。hemITAM以外にも幹細胞性誘導能を失うGPNMBの点変異体や欠失変異体も複数作製済である。また、患者のがんにおけるGPNMBの役割をさらに解析することを目的として、乳がん、膵がん、膀胱がんのオルガノイド培養と患者腫瘍組織異種移植モデルの作製も開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.GPNMBのリン酸化hemITAM特異抗体の作製：点変異により幹細胞性誘導能が失われることを明らかにしたヒトGPNMBのhemITAMを含むペプチドKKHKEYNPIENと同部位のリン酸化ペプチドKKHKEpYNPIENを合成し、リン酸化GPNMBhemITAM特異抗体と非リン酸化GPNMBhemITAM特異抗体を作製した。ウサギ抗血清からリン酸化ペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を精製したものでは、SRCによってリン酸化を誘導したGPNMBを特異的に検出することを確認した。モノクローナル抗体の作製は試みたが完成していない、今後も継続して、モノクローナル抗体の作製を目指す予定である。
2.GPNMBの特異糖化修飾の有無を検出する特異抗体の作製：ヒトGPNMBの特異糖化修飾部位を中心としたペプチドを付加したマウスIgG重鎖分子を合成し、ヒトGPNMBと同様に糖化就職を受けていることをMs/Ms解析で明らかにし、マウスを免疫して特異糖化修飾したGPNMBに特異的に結合する抗体と特異糖化修飾していないGPNMBに特異的に結合する抗体の作製を行い、スクリーニングを進めている。
3.GPNMBの細胞表面発現制御機構：GPNMBの種々の欠失変異体を作製し、細胞表面への発現の制御に必要な領域を解析した。
4.GPNMB結合分子の同定：スフェア培養したHs578T細胞を用いて、幹細胞性を獲得している休眠期がん細胞と幹細胞性のない増殖期がん細胞をFACSで分取し、GPNMBを細胞表面に発現している細胞を分取する方法を検討し、リン酸化hemITAMペプチドを用いたプルダウンアッセイで幹細胞性誘導に関与するシグナル分子を同定する研究を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗体の作製については、目的とする抗体ができるまでスクリーニングを続ける。平成30年度において、GPNMBの糖化修飾部位の抗原作製に成功したことで、この部位に対する抗体が作製できる目処が立ち、スクリーニングを進めている。これ以外にも、リン酸化修飾を受けるhemITAMと新たに重要性が確認されたセリン530を含むペプチドに対する抗体の作製も進めた。リン酸化hemITAMに特異的に結合するポリクローナル抗体は得られた。継続してモノクローナル抗体の作製を試みる。今後、これらの抗体の特異性を確認し、分子細胞生物学的実験や臨床病理学的実験に応用する予定である。
リン酸化hemITAMに結合するシグナル分子の同定については、GPNMBを細胞表面に発現している細胞を速やかにできるだけ多く回収する方法の確立とリン酸化hemITAMペプチドによってプルダウンされる少量サンプルのMs/Ms解析とともに、RNAシークエンシングによるパスウェイ解析も実施する。
GPNMBの細胞表面へのソーティングは、幹細胞性誘導を惹起する条件になっていると推察されるが、今のところ、種々の変異体を作製しても、この機構に異常のあるものは得られていない。この現象は、細胞増殖の停止が必要条件となると考えられたが、このことには細胞種によって違いがあることを示唆するデータも得られてきた。少なくとも乳がんや膵がん細胞ではこの現象が重要な制御機構になっていると思われ、これらの細胞での役割について引き続き解析する。
これまでの樹立がん細胞株を用いた研究に加え、より患者のがんの状態に近い、オルガノイド培養と患者腫瘍組織異種移植モデルの作製も開始している。今後、これらでもがん細胞の腫瘍製造職におけるGPNMBによる幹細胞性誘導の意義とこれを標的としたがん幹細胞治療の確立に向けた研究を推進する。
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[Presentation] The roles of TMEPAI in breast cancer cells2018
Author(s)
Meidi Utami Puteri, Bantari Wisynu Kusuma Wardhani, Riezki Amalia, Mohammed Abdelaziz, Yukihide Watanabe and Mitsuyasu Kato
Organizer
The 3rd International Conference on Advance Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
Int'l Joint Research
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