肝細胞癌におけるネオアンチゲンの同定と遺伝子改変T細胞による免疫療法の開発

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02794
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 水腰 英四郎 金沢大学, 医学系, 准教授 (90345611)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ネオアンチゲン / 遺伝子改変Ｔ細胞 / 免疫療法 / 肝細胞癌 / Ｔ細胞レセプター / 腫瘍関連抗原 / エピトープ

Outline of Annual Research Achievements

当教室において肝がんと診断され、外科的切除を行った20症例の切除肝がん組織をもちいて樹立した肝がん培養細胞を含めた4種類の培養細胞において、全エクソーム解析を行った。また、正常コントロールとして、それぞれの患者の末梢血リンパ球を用いて同様に全エクソーム解析を行い、両解析結果を比較することによって、それぞれの肝がん培養細胞の遺伝子変異部位を同定した。またこれらのデータをInternational Cancer Genome Consortium (ICGC)のがんゲノム解析データと比較し、共通のネオアンチゲン候補となる遺伝子変異を探索し、候補部位を同定した。候補となる遺伝子変異部位を中心として前後10アミノ酸を同定し、解析ソフト(BIMAS)を用いて各HLA分子に結合する細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）エピトープのアミノ酸配列を予測し、次年度に合成するペプチドのアミノ酸配列を決定した。
ネオアンチゲンならびにそのCTLエピトープの解析と平行して、上記培養細胞が発現する腫瘍関連抗原を同定した。具体的にはアルファフェトプロテイン（AFP）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、多剤耐性関連蛋白（MRP3）であり、それぞれの抗原エピトープを認識するＴ細胞レセプター（TCR）遺伝子改変Ｔ細胞を作製した。また、TCR遺伝子改変Ｔ細胞ががん細胞に対して傷害活性を示す工程をリアルタイムで観察できる画像システムを構築した。さらに、そのシステムを用いて、TCR遺伝子改変Ｔ細胞が実際に、それぞれの抗原特異的に肝がん培養細胞を傷害することを確認し、その傷害活性の強さ、活性発現までの時間を測定できるアッセイ系を確立した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の主要な課題である肝細胞がんにおけるネオアンチゲンの同定に関する研究工程は順調に進んでいる。また、Ｔ細胞レセプターを用いた遺伝子改変Ｔ細胞の作製手技に関しても、他の腫瘍関連抗原特異的なＴ細胞レセプター遺伝子を用いて作製に成功している。
さらに、肝がん培養細胞とＴ細胞レセプター遺伝子改変Ｔ細胞を用いた、傷害活性を測定するアッセイ系の確立に関しても、その工程の８０％程度まで成功している。

Strategy for Future Research Activity

今後は当初の計画どおり、同定した肝がん培養細胞の遺伝子変異とそのアミノ酸配列から予測したネオアンチゲンのエピトープとなりうる部位に対するペプチドを合成する。合成したペプチドと肝がん患者ならびに健常者20例の末梢血リンパ球を用いて、肝がんに特異的であることを高い精度で証明し、また免疫治療の標的として最適なものを選択するために、下記(a)～(c)に記す複数の免疫学的手法を用いてCTLエピトープの同定を行う。(a)ペプチドを用いたインターフェロンガンマELISPOTアッセイ・同アッセイの培養上清を用いたELISA法によるサイトカインの測定、(b)ペプチド特異的な細胞増殖能をみるためのProliferation アッセイ、(c) テトラマー染色とフローサイトメーターによる細胞表面マーカーのマルチカラー解析。これらの解析によって免疫治療により有用なエピトープを同定する。