Molecular mechanism of familial aortic dissection by smooth muscle myosin mutation and elucidation of vascular aging mechanism

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02811
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 永井 良三 自治医科大学, 医学部, 学長 (60207975)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相澤 健一 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70436484) ; 仲矢 丈雄 自治医科大学, 医学部, 講師 (80512277) ; 宮川 拓也 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (50596559) ; 田之倉 優 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任教授 (60136786) ; 今井 靖 自治医科大学, 医学部, 教授 (20359631)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 平滑筋ミオシン / 家族性大動脈解離 / 血管老化機構

Outline of Annual Research Achievements

急性大動脈解離は致死性疾患である。その病態機序には不明の点が多い。我々は平滑筋ミオシン遺伝子Myh11の新規変異（Exon29 del 1263K）による遺伝性大動脈解離の家系を同定し、同一変異による大動脈解離モデルマウスを樹立した。この変異は平滑筋ミオシン重鎖尾部の4連続リジン残基が3連続に変化しており（4K→3K）、成長と共に大動脈平滑筋が収縮型形質から合成型に転換する。これは血管の早期老化である。しかし平滑筋ミオシン変異による血管老化と大動脈解離の分子機構は解明されていない。本研究では、我々が開発した平滑筋ミオシン変異（Exon29 del 1256K）マウスを用いて、平滑筋ミオシン変異の果たす役割を動脈、膀胱、子宮等種々の臓器で解析した。その結果、変異体マウスはアンジオテンシンIIの持続注入により、容易に大動脈解離を生じる。また、血管収縮反応が低下していることを見出した。また、エラスチン遺伝子の発現や細胞接着に関わるFAKの低下が明らかとなった。今後、平滑筋ミオシン変異による細胞形質転換及び大動脈解離の分子機構を、平滑筋形質転換因子であるKLF5、Wnt/βカテニンシグナル、SASP因子(細胞老化関連分泌現象)、ATM等から解析する。平滑筋ミオシン変異蛋白の分子構造解析も順調に進行している。Myh11のK1256を含むライトメロミオシン(LMM)フラグメントの結晶構造を分解能3.5Åで決定した。その結果、LMMフラグメントのN末端領域がコイルドコイルを形成することが示された。一方、LMMフラグメントのK1256を含む4つの連続したリジン残基（4K配列）とそれよりC末端側の領域では電子密度が観測されなかった。このことから、当初予測とは異なりLMMフラグメントのコイルドコイルは4K配列で解れて揺らいだ構造をとることが強く示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究２年目も計画通りに進展した。平滑筋ミオシン遺伝子Myh11の新規変異（Exon29 del 1263K）マウスと野生型マウスの表現型を比較検討した。組織学的にはホモ接合型（Myh11ΔK/ΔK）において大動脈は中膜と外膜の壁厚の増加を示した。電子顕微鏡で平滑筋細胞の変性、エラスチンの重層、および細胞接着を観察した。血管壁で発現するRNAおよび蛋白発現の定量的解析により、エラスチンおよびフォーカルアドヒージョンキナーゼ（FAK）の発現は、Myh11ΔK/ΔKマウス大動脈において減弱していた。マグヌス装置を用いた大動脈リング標本による大動脈の収縮・弛緩機能検査により、フェニレフリンないし塩化カリウムによるMyh11ΔK/ΔKマウス大動脈の等尺性張力は、野生型マウスと比較して有意に減少していた。また、各遺伝子型のマウスで大動脈負荷刺激(アンギオテンシンII持続注入)を行い、大動脈解離発症モデルを作成した。ヘテロ接合性（Myh11ΔK/＋）マウスはアンジオテンシンII刺激による大動脈解離発症モデルで、大動脈解離および壁内血栓を示した。また、ミオシンdel1263K変異が血管脆弱性を生じるメカニズムを細胞レベルで解析するため、iPS細胞の樹立を行った。変異体では野生型と比較し、iPS誘導効率の差を認めなかった。一方、変異体では樹立後のiPS細胞の様粒状化を認め、増殖を停止して継代ごとに細胞数が減少することが確認された。分子構造解析では、Myh11のK1256を含むLMMフラグメントとそのK1256欠損体の各種コンストラクトを調製し、X線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、K1256を含むLMMフラグメントの構造を分解能3.5Åで決定することに成功し、LMMの4K配列とその周辺の領域の構造情報を取得した。さらにLMMフラグメントの動的構造に対するK1256欠損の影響を解析するため、LMMフラグメントとそのK1256欠損体のX線小角散乱データを収集した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、昨年度に引き続き平滑筋ミオシン遺伝子Myh11の新規変異（Exon29 del 1256K）マウスで認めた表現型の分子機序を解明する。大動脈の収縮・弛緩機能、バイオマーカー、大動脈の組織学的評価、血管壁で発現するRNAの定量的解析、血管平滑筋ミオシンの分子機能など）を解析する。また、FAK、Smad2やMMPsなどの抑制効果が期待できる薬物（ATM阻害薬、KLF阻害薬等）を疾患発症モデルにin vivo投与し、血管脆弱性の改善が示されるか検討する。また、Myh11ミオシン変異マウスが血管と全身の老化にどのような影響をもたらすか、過剰栄養などのストレスを加えたときの代謝調節機能を検討する。またSASP因子の発現、全身臓器の細動脈血管機能、動脈硬化促進作用（ApoEノックアウトマウスとの交配）などを検討するとともに、詳細な分子メカニズムについてATMを中心に明らかにする（ATMノックアウト 、p53ノックアウトマウスとの交配を行う）。さらに、樹立したiPS細胞を解析することにより、ミオシンのdel1263K変異が血管脆弱性を生じるメカニズムを細胞ないし分子レベルで明らかする。構造学的には、Photon Factoryにおいて収集したLMMフラグメントのX線小角散乱データの解析を進めることで、結晶構造において観測された4K配列及びそれよりC末端側の領域の動的構造を検証する。さらにK1256欠損がLMMフラグメントの動的構造に与える影響を明らかにするため、K1256欠損体のX線小角散乱データとの比較解析を検討する。