2018 Fiscal Year Annual Research Report
異種動物間キメラを用いた多能性幹細胞による肺臓器創出
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18H02817
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
西條 康夫 新潟大学, 医歯学系, 教授 (10270828)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笹岡 俊邦 新潟大学, 脳研究所, 教授 (50222005)
味岡 洋一 新潟大学, 医歯学系, 教授 (80222610)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 胚盤胞補完法 / 肺再生 / ＥＳ細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Cas9を用いて作出したFGF10 exon1 ヘテロ変異マウス（FGF10Ex1-/+）とFGF10exon3ヘテロ変異マウス（FGF10Ex3-/+）を交配させたところ、産仔は、FGF10Ex1-/- とFGF10Ex3-/-と同様に、肺が完全欠損していることが明らかとなった。そこで、FGF10Ex1-/+とFGF10Ex3-/+を交配させ胚盤胞を得た。この胚盤胞は1/4の確率でFGF10Ex1/Ex3複合ヘテロとなることが予想される。この胚盤胞に、野生型のGFP陽性ES細胞を移入させたのち、偽妊娠マウス子宮に移入し産仔を得た。得た産仔のうち、GFP陽性キメラマウスを継続して飼育した。キメラ率は50%前後であったが、30%は死亡していた。計33匹の生きたキメラマウスを得ることが出来たが、離乳まで生存したのが、11匹に減じた。11匹の遺伝子解析を行ったところ、２匹がFGF10Ex1/Ex3複合ヘテロであることが判明した。この肺組織を免疫蛍光法で２重染色を行い解析した。その結果、１型、２型肺上皮、気管上皮細胞、肺血管内皮細胞のほぼ100%がES細胞由来であることが判明した。一方、肺間質細胞はGFP院陰性細胞が混在していた。肺臓器の大多数の細胞はES細胞由来であることが明らかとなった。以上より、肺欠損マウスにおいて、胚盤胞補完法により、ＥＳ細胞由来の肺臓器作出が可能であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FGF10Ex1/Ex3複合ヘテロマウスを用いることにより、ES細胞由来の野生型ゲノムが混じっても、確実に、複合ヘテロマウスであることが証明できる実験系を確立した。更に、２匹ではあるが、肺を欠損するFGF10Ex1/Ex3複合ヘテロマウスにES細胞由来の肺を作出することに成功した。また、肺組織の解析を行った結果、間質細胞の一部を除いて、ほぼES細胞由来であることが判明した。また組織学的に、正常肺として成熟していた。
３年計画の１年目としては、マウス数は少ないが、ES細胞由来肺を作出することに成功しており、進捗は順調と判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、キメラマウスの離乳後生存率が低く、解析マウスを得ることが困難であるため、解析マウス数を増やす必要がある。そこで、出生直後に全て安楽死させ、マウスの遺伝子解析を行う。キメラマウスを全て遺伝子解析することにより、複合ヘテロマウスにおけるキメラ率や、キメラマウスにおける複合ヘテロマウスの割合を算出し、FGF10複合ヘテロマウスが肺作出にいいモデルか評価する。胚盤胞の効率が悪くなかった場合は、このFGF10複合ヘテロマウスの胚盤胞に、GFP発現ラットES細胞を移入し、ラットES細胞由来の肺が作出可能かの実験を行う。一方で、FGF10複合ヘテロマウスは、肺以外に、四肢欠損をするため、今後大型動物の実験を考え、肺のみを欠損するマウスモデルを作成する必要がある。そこで、TTF-1（Nk2.1）遺伝子変異マウスモデルを作成する方針である。
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