2018 Fiscal Year Annual Research Report
Next generation therapy of podocytopathy developed by renal organoid
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18H02827
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
松阪 泰二 東海大学, 医学部, 教授 (50317749)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒岡 利和 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (40437661)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | オルガノイド / ポドサイト / 腎臓病 / ネフローゼ症候群 / ネフロン前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イムノトキシンLMB2の静注によりポドサイト特異的傷害の誘発が可能なNEP25マウスの胎児腎臓を採取し、CDP法を行って、NPC細胞株を樹立した。このNPCを培養し、分化を誘導してオルガノイドを作成した。20 nMのLMB2を添加すると、ポドサイト特異的タンパク質であるpodocalyxinの発現の消失を確認し、オルガノイドにおいてもLMB2によるポドサイト特異的傷害誘導が可能である事が示された。
ポドサイト特異的にHAタグ付加リボゾーム蛋白Rpl22を発現するRibotag/Nephin-Creマウスの胎児腎を採取し、CDP法を行って、NPC細胞株を樹立した。このNPCを培養し、分化を誘導してオルガノイドを作成した。このオルガノイドにおいて、nephrinを発現するポドサイトに、HAが発現していた。オルガノイドのホモゲネートから、抗HA抗体による免疫沈降によりRNAを採取し、ポドサイト特異的mRNAが濃縮されている事を確認した。すなわち、腎オルガノイドからポドサイトRNAの単離方法が確立された。
NPCの効率的遺伝子改変方法の確立をめざして、lipofection法を試みたが、NPCの細胞特性が変化してしまった。Electroporation法を試みたが、導入細胞の薬剤選択が有効になされなかった。CRISPR-Cas9系を用いた遺伝子改変法の開発を目的に、Cas9 knock-inマウスを導入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NPCの培養、分化誘導、オルガノイドの形質解析を安定してできるようになり、またCDP法によりNEP25マウスのNPCと、Ribotag/Nephrin-CreマウスのNPCの樹立に成功した。さらに、LMB2によるポドサイト傷害の誘導が可能であり、またポドサイト特異的RNAの採取も可能である事を示せた。これらは、本計画の本幹技術で、様々な苦難はあったものの、まずは順調に達成された。簡便な遺伝子導入方法の開発は、試みたものの現在のところ成功していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
NEP25/Ribotagマウス由来腎オルガノイドにイムノトキシンLMB2を作用させて、ポドサイト傷害を誘発し、傷害前後のポドサイトRNAを採取する。in vivoのNEP25マウスのポドサイトで傷害後に変動を示した遺伝子に関して、オルガノイドポドサイトでも同様の変動が認められるか定量RT-PCR法で調べる。同様の実験をpuromycinで傷害する事により行い、変動するRNA変化が普遍的かどうか検証する。
NEP25由来NPCとRibotag 由来NPCを混合させて、キメラオルガノイドを作成する。これにLMB2を作用させて、NEP25 NPC由来ポドサイトを傷害する。HA抗体による免疫沈降により、Ribotag NPC由来ポドサイト(hCD25非発現)のRNAを採取する。in vivoでは、hCD25発現・非発現ポドサイトが混在するモザイクマウスでは、hCD25非発現ポドサイトも二次的傷害をうけたが、キメラオルガノイドで同様の現象が認められるかどうか検証する。
tdTCas9 knock-inマウスをSix2-Creマウスと交配し、胎児腎からCDP法でCas9発現NPCを樹立する。このNPCは、gRNAのみの導入により、容易に遺伝子改変が可能であると期待される。このNPCを用いて、遺伝子改変オルガノイドを作成する事をめざす。
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[Presentation] Autophagy Protects Kidney Proximal Tubules from Phosphate-Mediated Mitochondrial Dysfunction2018
Author(s)
Ryuta Fujimura, Takeshi Yamamoto, Yoshitsugu Takabatake, Satoshi Minami, Atsushi Takahashi, Tomoko Namba, Jun Matsuda, Shinsuke Sakai, Isao Matsui, Fumio Niimura, Taiji Matsusaka, Yoshitaka Isaka
Organizer
ASN Kidney Week
Int'l Joint Research
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