2018 Fiscal Year Annual Research Report

皮膚炎症と発癌：表皮Regnase-1の関与についての研究

Research Project

Project/Area Number	18H02833
Research Institution	Kochi University
Principal Investigator	佐野栄紀高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 教授 (80273621)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高石樹朗高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 助教 (10303223) 山本真有子高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 助教 (20423478) 石元達士高知大学, 医学部附属病院, 医員 (40750039) [Withdrawn] 森坂広行高知大学, 医学部附属病院, 医員 (60826840)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	皮膚炎症 / 皮膚癌 / 細胞内シグナル / ２段階発癌モデル / 紫外線誘発発癌モデル
Outline of Annual Research Achievements	Regnase-1(Reg1) ノックアウトマウス(KO)を用いた皮膚発癌促進機序本研究の意義：皮膚慢性炎症と発癌の関連を明らかにする。RNase活性を持つRegnase-1 (Reg1)は、ケモカインあるいはサイトカイン等のmRNAを分解することにより炎症の制御に関わっている。我々は、表皮特異的Reg1ノックアウト(KO)マウスはimiquimod誘導性皮膚炎、接触過敏反応の重症化、遷延を証明し報告した。Reg1はNF-κBあるいはAP-1のシグナリングにも関与することで癌細胞の悪性度を制御することが報告されている。しかしながら、炎症制御に関わる表皮Reg1が皮膚癌発症にどのような役割を果たしているのか明らかではない。我々は、この問いを明らかにするため、表皮特異的Reg1KOをもちいて以下の実験を行った。 (1) DMBA/TPA発癌モデル；生後8から9週齢のC57BL/6マウス背部皮膚に発癌イニシエーターである7,12-dimethylbenz-[a]anthracene(DMBA)を１回塗布し、その後、発癌プロモータである12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)を週2回同部位に塗布することにより皮膚発癌誘導した。その結果、Reg1KOにおいては対照に比べて発癌までの潜伏期間が著明に短縮、発症頻度、腫瘍個数も著明に増加していることが明らかになり、Reg1が炎症のみならず発癌の抑制にも関与していることが示された。 (2) 紫外線誘導発癌モデル；生後8から9週齢マウスに紫外線を週３回（200 mJ/cm2）照射したところRegKOは対照群にくらべて、早期より表皮肥厚が生じ、一部では表皮細胞の核異型を認めた。これはReg1ノックアウトすることで、紫外線照射後により強い表皮炎症が誘導されたのみならず表皮増殖シグナルの異常が招来したことを示す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ノックアウトマウスを用いた２つのin vivo発癌モデル系で、炎症に関わるRegnase-1が発癌制御にも関与することが示された。
Strategy for Future Research Activity	２段階化学発癌系①このtwo-stage発癌系で生じる早期皮膚癌組織よりRNAを採取、microarrayで遺伝子発現解析を行う。②この発癌系においてmaster mutationとして知られているh-ras遺伝子変異の解析③炎症、発癌にも関わるCOX2などアラキドン酸代謝経路の関与の有無。④COX1阻害剤であるインドメタシン、アスピリン、COX2阻害剤であるメロキシカム、ニメスリド、またCOX1,2いずれも阻害するピロキシカムを用いて、Reg1KOマウスにおいて化学発癌が抑制できるか検討する。また、COXの関与が示唆される結果である場合は、Reg1KOマウスにおいて、COX1, 2遺伝子をそれぞれCRISPR-Cas9でKOすることで発癌抑制の有無を検討する。紫外線誘導発癌系①in vitro培養RegKO角化細胞を紫外線照射し、その増殖、アポトーシスの解析②そのときの角化細胞シグナル（例えばNFkB, ERK1/2, Stat3, Stat1など）の変化を対照角化細胞と比較し解析する。③同時に遺伝子発現アレイを行う。 Reg1過剰発現マウスの作成；現在、keratin5プロモータ下でReg1トランスジェニックマウスを作成中であるが、テクニカルな要因のため成功していない。おそらく胎生致死となる可能性を示唆するものであるため、tetONなど誘導系プロモータを用いて再検討を行う。