2018 Fiscal Year Annual Research Report
肥満に伴うM2マクロファージ活性化障害とインスリン抵抗性の分子機構
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18H02860
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
窪田 直人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50396719)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 糖尿病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（I）肥満におけるM2Φa活性化障害の分子機構
MΦ特異的IRS-2欠損（MIRS-2KO）マウスは高脂肪食下において、耐糖能異常、インスリン抵抗性を呈した。そこでまず、脂肪組織における炎症性サイトカイン発現、浸潤 MΦ量、M1/M2a/M2b/M2cΦの量や割合を検討した。さらに脂肪組織を脂肪細胞分画とSVF分画に分離し、SVF分画を用いたFACS解析によるM1/M2マーカー遺伝子の発現を検討した。代表的なM2aΦマーカー遺伝子であるArginase1やFIZZ1、Ym1、Mgl1などの減少が認められたため、さらにその活性も測定し、確かに M2aΦ活性が減弱していることを確認した。またシグナル伝達機構を解析するため、IRS-2 の下流に存在すると考えられる、PI3K/Akt/FoxO1 経路について、IL-4 刺激後の Akt のリン酸化レベル、constitutively active(CA) FoxO1やFoxO1ノックダウンの系によるM2aΦマーカー遺伝子の発現変化を検討した。 PI3K 阻害薬のLY294002の添加によりIL-4によるArginase1やFIZZ1、Ym1、Mgl1活性化が減弱していた。さらにFoxO1を介した発現調節機構を検討するため、代表的な M2aΦマーカー遺伝子であるArginase1プロモーター領域をクローニングし、RAW264.7cells を用いてFoxO1による活性化を検討するとともに、FoxO1結合領域を同定し、mutationを入れることでその活性が失われることを確認した。この領域を用いてCHIP assayを行い、確かにFoxO1がこの領域に結合することを証明するとともに、EMSA解析によりFoxO1とcomplexを形成している分子についても検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年10月、条件設定のための予備実験の結果、独立して作用していると考えられたM2マクロファージ分画間に、当初は想定していなかった新たな相互作用の可能性を発見した。本研究遂行上、この作用の本質を見極めることが必要であるので、条件検討を行い、FACS解析と共培養実験による解析を行った上で各マクロファージ分画採取法確立本実験を実施する必要が生じた。いずれも解決しむしろ新たな展開が研究の飛躍につながっており、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
M2bΦはM1ΦとともにTNFαやIL-1βにより活性化され、IL-10を産生し炎症を抑制する。従って慢性炎症はM2aΦ活性低下とは独立に、同じリガンドによって活性化されるM1ΦとM2bΦの反応性の差による相対的M2bΦ活性化障害が原因となっている可能性がある。またM1Φ＞M2aΦ+M2bΦ+M2cΦと考えた場合、Arginase1等を分泌するM2aΦとIL-10等を分泌するM2bΦ+M2cΦの病態形成における役割の違いは重要である。M2aΦにおけるIL-10の挙動がArginase1やFIZZ1、Ym1、Mgl1等とは異なることを踏まえ、CD206, CD301, CD200R, CD163, CD86, MHCII, LAMなどの表面マーカーを利用したFACS解析により各MΦを分離し、TNFαやIL-1βによる用量反応性やタイムコースをM1Φ、M2bΦ/M2cΦで比較検討すると共に、高グルコース、高インスリン、高パルミチン条件下等でその反応性の変化を検討し、肥満におけるM2bΦ/ M2cΦ活性化障害メカニズムを解明する。もし高インスリン条件下で障害を認めた場合にはMIRS-2KOマウスでこの表現型がrescueされるかどうか検討する。
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[Journal Article] The RNA Methyltransferase Complex of WTAP, METTL3, and METTL14 Regulates Mitotic Clonal Expansion in Adipogenesis.2018
Author(s)
Kobayashi M, Ohsugi M, Sasako T, Awazawa M, Umehara T, Iwane A, Kobayashi N, Okazaki Y, Kubota N, Suzuki R, Waki H, Horiuchi K, Hamakubo T, Kodama T, Aoe S, Tobe K, Kadowaki T, Ueki K
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Journal Title
Mol. Cell Biol.
Volume: 38
Pages: e00116-00118
Peer Reviewed / Open Access
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[Book] 医と食2018
Author(s)
窪田 哲也、窪田 直人、門脇 孝
Total Pages
4
Publisher
(公社)生命科学振興会「医と食」編集部
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