2018 Fiscal Year Annual Research Report
Innate immune receptor and alternative autophagy in pathogenesis of prosthetic joint infection
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18H02917
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
高木 理彰 山形大学, 医学部, 教授 (40241707)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高窪 祐弥 山形大学, 医学部, 准教授 (80431641)
伊藤 重治 山形大学, 医学部, 助教 (50764122)
大木 弘治 山形大学, 医学部, 非常勤講師 (20463812)
佐々木 幹 山形大学, 医学部, 非常勤講師 (00444034)
長沼 靖 山形大学, 医学部, 客員研究員 (10463811)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工関節 / インプラント感染 / 生体反応 / オートファジー / 自然免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、病理組織学的検索として、感染人工関節周囲組織(PJI)、非感染性弛緩人工関節周囲組織、変形性関節症、関節リウマチ由来滑膜組織を用い、パラフィン包埋組織切片のHE染色による細胞形態評価と凍結組織切片の免疫組織染色によりマクロファージ、好中球、線維芽細胞を同定した。免疫組織学的検討として、マクロファージ、好中球、線維芽細胞におけるTLR、NLR及びそれらの関連分子、さらに選択的オートファジー関連分子の共局在を蛍光二重染色法で判定した。また、透過型電子顕微鏡による超微細組織を観察し、細胞内で選択的オートファジーの特性を示すオートファゴゾームを同定した。免疫電顕・CLEMにより選択的オートファジーの特性を示す構造物におけるTLR、NLR、オートファジー関連分子の局在を観察した。インプラント動物モデルをマイクロインプラントシステムにより作成し、インプラント周囲の組織を摘出、組織反応、細胞形態評価を行った。免疫組織学的検討として、蛍光二重染色法で判定した。培養細胞解析のため、FACS解析でマウス大腿骨から骨髄細胞を採取し培養した。各分画におけるCD68/CD11b, CD15, Prolyhydro
xylase/CD331発現率を蛍光抗体標識FACSで解析した。RNA干渉法によるmRNA、蛋白発現を検討した。TLR2、TLR4、NLRP3欠損マウス、顆粒球系・単球系Atgコンディショナルノックアウトマウスを用いて、各自然免疫受容体の欠失並びにオートファジー機構欠失による組織、細胞反応を明らかにした。CASMab法を応用しながら、解析用モノクロナル抗体の樹立・応用し、免疫刺激したマウス脾臓細胞からハイブリドーマを作成し、抗体を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
感染人工関節周囲組織 (PJI)、非感染性弛緩人工関節周囲組織、変形性関節症、関節リウマチ由来滑膜組織の病理学的検討を行えた。また、透過型電子顕微鏡による超微細組織を観察可能であった。免疫電顕・CLEMにより選択的オートファジーの特性を示す構造物におけるTLR、NLR、オートファジー関連分子の局在も観察可能であった。インプラント動物モデルをマイクロインプラントシステムにより作成可能であった。RNA干渉法によるmRNA、蛋白発現を検討可能であった。コンディショナルノックアウトマウスを用いて、各自然免疫受容体の欠失並びにオートファジー機構欠失による組織、細胞反応を明らかにできた。CASMab法を応用しながら、免疫刺激したマウス脾臓細胞からハイブリドーマを作成し、抗体を樹立可能であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度得られた基礎的結果、組織検体、培養細胞、抗体を使用し、以下の実験を施行していく。菌体凍結乾燥粉（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌）、lipopeptide、peptide glycan、triacyl lipopeptide、diacyl lipopeptide、LPS、flagellin、dsRNA、ssRNA、非メチル化CpG DNAを水溶性ないし脂溶性液体として用いて、菌体成分刺激試験を行う。インプラント動物モデルを用いて、マイクロインプラントに液体化した各菌体成分を無菌的に塗布、乾燥させてマウス体内に挿入し、病理組織学的解析を比較解析する。培養細胞のFACS並びにmRNA / 蛋白発現解析として、培養細胞系において、液体化した各菌体成分を培養液に添加して、菌体成分刺激により、今年度同定した抗体を用いて分子発現動態を解析する。RNA干渉法によるmRNA、蛋白発現の検討：実験Dの培養細胞系において、体化した各菌体成分を培養液に添加して、同様に菌体成分刺激による分子発現動態を解析する。ノックアウトマウスを用いた組織、培養細胞の検討：実験Eの動物実験、培養細胞系において、それぞれ各菌体成分刺激を行い、病理組織並びに培養細胞の分子動態を解析する。
以上の病理学的検討と動物および細胞を用いた実験から、感染人工関節 (PJI)におけるマクロファージ、好中球、線維芽細胞の分布動態と特性、さらに各細胞群において、TLR、NLR、選択的オートファジー関連分子の機能解析を中心に、PJIにおける自然免疫・選択的オートファジーの病態特性を明らかにする。研究に利用可能な抗体の作成も継続して行う。
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